shRNA knockdown

1.

Метод подавление экспрессии генов интереса
c помощью коротких РНК-шпилек (shRNA)
к.б.н., вед.н.с. Злотина Анна Михайловна
Институт молекулярной биологии и генетики
НМИЦ им. В.А. Алмазова Минздрава РФ

2.

3.

Механизм РНК интерференции
Инъекция в C. elegans РНК мышечного белка

4.

Лентивирусная доставка shRNA и
механизм РНК-интерференции в
клетках млекопитающих
Инъекция в C. elegans РНК мышечного белка

5.

Создание лентивирусных конструктов, несущих короткую
РНК-шпильку (shRNA)
Вектор для клонирования: pLKO.1-TRC
Дизайн и заказ shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1
Клонирование олигонуклеотидов в вектор pLKO.1
(отжиг F- и R- олигов, рестрикция и очистка вектора, лигирование,
трансформация E.coli, селекция клонов
Сборка лентивирусных частиц с использованием
линии клеток HEK293T
Трансдукция вирусом исследуемой культуры клеток и
селекция успешно трансдуцированных клеток

6.

1. Вектор для клонирования: pLKO.1-TRC
Промотор U6 человека: транскрипция shRNA с помощью РНК полимеразы III
cPPT (центральный полипуриновый тракт): эффективность трансдукции
Puro R: ген устойчивости к пуромицину
3`,5` LTR: long terminal repeats
F1, pUC ori: бактериальные ориджины репликации
Amp R: ген устойчивости к ампицилину
https://www.addgene.org/

7.

2. Дизайн shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1
Выбор подходящей мишени длиной 21 н. в гене интереса

8.

2. Дизайн shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1
Выбрать подходящую мишень длиной 21 н. в гене интереса
Геном человека, мыши (крысы)
Ген-мишень (название, ID, нуклеотидная последовательность)
Конкретный мРНК-транскрипт / все альтернативные транскрипты гена мишени
Scores:
Эффективный нокдаун гена интереса !
Специфичность: подавление только гена-интереса,
но не других генов (off-targets) !!!
Клонируемость

9.

https://www.invivogen.com/sirnawizard/index.php

10.

11.

https://en.vectorbuilder.com/tool/shrna-target-design.html

12.

13.

2. Дизайн shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1
https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/gene/search
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

14.

2. Дизайн shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1

15.

2. Дизайн shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1

16.

2. Дизайн shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1

17.

2. Дизайн shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1

18.

2. Дизайн shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1
Общие принципы подбора таргетной последовательности
CDS (кодирующие области гена), 5`,3` UTRs
Искать 21-меры, начиная с 25-го нуклеотида downstream от cтарт-кодона (ATG) и
заканчивая 100-150-м нуклеотидом upstream от стоп-кодона
избегать однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs)
Соблюдать содержание GC : ~ 30-55%
Избегать ≥ 4 подряд идущих одноименных нуклеотидов (особенно polyT); ≥ 6 G+C (пр, GCCGGC),
сиквенсы-палиндромы.
3` конец: избегать высокого GC состава
Должно быть , как минимум, 3 mismatch-нуклеотида относительно других генов (BLAST)

19.

2. Заказ shRNA олигонуклеотидов для клонирования в pLKO.1
Forward oligo: 5’ CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG 3’
Reverse oligo: 5’ AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense 3’
Пример: последовательность-мишень AATGCCTACGTTAAGCTATAC
Олигонуклеотиды:
Forward oligo: 5’
CCGG AATGCCTACGTTAAGCTATAC CTCGAG GTATAGCTTAACGTAGGCATT TTTTTG 3’
Reverse oligo: 5’
AATTCAAAAA AATGCCTACGTTAAGCTATAC CTCGAG GTATAGCTTAACGTAGGCATT 3’

20.

3. Клонирование олигов в вектор pLKO.1
Аннилинг (отжиг) Forward и Reverse олигонуклеотидов (20мкМ)
AgeI+EcoR1 К
Рестрикция плазмиды с помощью эндонуклеаз
рестрикции AgeI и EcoRI (липкие концы)
Линеаризованный
Вектор (~ 7kb)
Очистка линеаризованного вектора из агарозного геля
фрагмент
1.9 kb
Лигирование вектора и олигонуклеотидов (T4 лигаза)
Трансформация вектором бактерий E.coli (o/night)
Скрининг клонов на наличие и корректность вставки shRNA
- выделение плазмидной ДНК 3-5-10 клонов (минипреп)
- таргетное секвенирование по Сэнгеру региона вставки shRNA
- наработка плазмиды (миди/максипреп)
ДНК электрофорез
в 1% агарозном геле

21.

3. Клонирование олигов в вектор pLKO.1
Скрининг клонов на наличие и корректность вставки shRNA
Оценка размера плазмиды, концентрации и качества выделенной ДНК
Таргетное секвенирование по Сэнгеру региона вставки shRNA
Подбор условий секвенирования
сложно-организованного района шпильки!

22.

4. Сборка лентивирусных частиц с использованием линии клеток HEK293T
HEK293T-линия продуцент:
Посев HEK293T (день1)
Котранфекция смысловой плазмидой, плазмидами PAX2 (упаковка капсида) и
MD2.G (белки оболочки) (день2)
Сбор кондиционированной среды , концентрирование вируса (optional) (день 4)
Микс плазмид
Котрансфекция HEK293T
Сбор лентивирусных частиц
Трансдукция исследуемой линии
клеток
Селекция клеток, стабильно экспрессирующих РНК-шпильку, на среде с пуромицином
(1-10 мкг/мл)