Технология рекомбинантных ДНК. (Лекция 3)

1.

Лекция 3
Технология рекомбинантных ДНК
Профессор Хрусталева Л.И.
С использованием ряда слайдов,
подготовленных к.б.н. Фесенко И.А

2.

Клонирование ДНК in vivo
Вектор
Размер
клонируемой ДНК
плазмида
20 kb
космида
40 kb
BAC
300 kb
YAC
1000 kb

3.

Космиды – векторы , созданные путем вставки COS
последовательности от фага в небольшую (5 kb)
плазмиду. Клонирование осуществляют в E. coli.
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) – векторы
(кольцевые), созданные на основе бактериальной
F-плазмиды. Клонирование осуществляют в Е. coli.
YAC (Yeast Artificial Chromosome) – векторы (линейные),
представляющие собой искусственную дрожжевую
хромосому, в состав которой входит дрожжевые ориджин
репликации, теломеры, центромеры и вставленный
участок геномной ДНК животного.
Клонирование
осуществляют в дрожжевых клетках.

4.

Секвенирование ДНК – определение последовательности
нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК

5.

Секвенирование ДНК

6.

Секвенирование ДНК

7.

Секвенирование ДНК

8.

Саузерн-блоттинг
Радиоактивно
меченная
ДНК-зонд
Фрагменты
хромосомной ДНК
после рестрикции
Разделение
фрагментов в гельэлектрофорезе
Денатурация и перенос
одноцепочечных фрагментов ДНК
(блоттинг)
Фрагмент ДНК,
комплементарный
ДНК-зонду

9.

Саузерн-блоттинг
Более 500 наследственных болезней человека связаны с
нарушениями какого-то одного гена
Дородовая диагностика наследственных болезней
Серповидноклеточной анемия – нуклеотидная замена в β-цепи
гемоглобина GAG на GTG
ДНК здорового плода
GAG
GTG
ДНК плода с
серповидноклеточной анемией
GAG
GTG

10.

Нозерн-блоттинг
Радиоактивно
меченная
ДНК-зонд
Молекулы иРНК
Разделение
фрагментов в гельэлектрофорезе
Перенос РНК на мембрану
(блоттинг)
Молекула иРНК,
комплементарная
ДНК-зонду

11.

Полимеразная цепная реакция
ПЦР

12.

ПЦР – быстрый и эффективный метод, позволяющий in
vitro амплифицировать, или делать много копий,
небольших фрагментов ДНК
Полимеразная цепная реакция была изобретена в середине
80-х
годов
имела
революционное
значение
для
молекулярной
биологии,
медицинской
диагностики,
судебной экспертизы, эволюционной биологии и мн.др.
Cary Mullis во время вручения
Нобелевской премии в 1993

13.

В ПЦР используются особенности репликации ДНК:
-для копирования ДНК используется ДНК-полимераза
- однонитевая ДНК-матрица (получают нагреванием раствора ДНК)
- точка начала копирования определяется с помощью праймеров
- ДНК-полимераза использует нуклеотиды для строительства новых
цепей

14.

ДНК-полимераза начинает копирование присоединением
нуклеотидов к праймеру
праймер
3’
5’
5’
3’
Праймер – одноцепочечный
фрагмент ДНК, образующий
затравку на ДНК-матрице

15.

ПЦР реакция включает в себя 3 этапа:
Денатурация – на этом этапе создается
одноцепочечная ДНК, при температуре 940С
Отжиг праймеров – на этом этапе праймеры
гибридизуются с матричной ДНК, создавая затравку
Элонгация – на этом этапе ДНК-полимераза
синтезирует новые цепи (при температуре 720С)

16.

Повторяющиеся циклы,
включающие денатурацию
ДНК-мишени, отжиг
праймеров, последующее
удлинение праймеров дают
огромное количество ДНК

17.

Начальный материал для ПЦР это небольшое
количество ДНК ( может быть даже одна молекула
ДНК) , содержащая нуклеотидную
последовательность, которую необходимо
клонировать.
Важное усовершенствование техники ПЦР произошло
после открытия бактерий, живущих в горячих
источниках. ДНК-полимераза этих бактерий работает
при температуре 720С.
Изначально, для ПЦР использовалась ДНК-полимераза
кишечной палочки, но этот фермент чувствителен к
температуре и разрушается при денатурации ДНК.
ДНК-полимераза выделенная из этих бактерий
называется Taq-полимераза.

18.

• термостабильна
• не обладает 3’-5’ экзонуклеазной активностью

19.

Области применения ПЦР
Диагностика инфекционных заболеваний
Преимущества применения ПЦР:
1. ПЦР выявляет специфическую ДНК возбудителя и прямо
указывает на возбудителя инфекции

20.

2. Высокая чувствительность – ПЦР дает возможность
обнаруживать патогенные бактерии и вирусы даже в тех
случаях, когда другими методами их выявление
невозможно.
3. Высокая специфичность – в исследуемом материале
выявляется уникальный, характерный
данного возбудителя фрагмент ДНК
только
для
4.
Быстрота получения результата – определение
возбудителя занимает около 1 дня
5.
Работа с любым биологическим материалом –
возможна детекция в материале полученном от больного
животного
6. Безопасность работы с исследуемым материалом –
материал может быть дезинфицирован перед работой

21.

В ветеринарии используют наборы для определения
туберкулеза, сибирской язвы, чумы свиней, чумы
плотоядных, хламидиоза, микоплазмоза у птиц,
бешенства
Срок диагностики составляет 8-10 часов
ПЦР также используется для определения
микробиологического загрязнения в продовольствии,
косметике, лекарственных препаратах. Разработаны
наборы для диагностики загрязнения сальмонеллой,
стафиллококом, листерией.

22.

В палентологии
С помощью ПЦР можно амплифицировать ДНК из
ископаемых остатков. Например, из листьев растения
обнаруженных в пластах миоцена (около 18 млн.) была
выделена ДНК и использована для ПЦР. Была
клонирована часть гена 1,5-рибулозобифосфат
карбоксилазы. На основе данных о нуклеотидном
составе этого участка растение было отнесено к
семейству Магнолиевых

23.

Маркирование геномов животных
Целью широкомасштабного картирования генов на
хромосомах с/х животных является разработка
молекулярно-генетических маркеров, тесно сцепленных
с главными генами хозяйственно-ценных признаков
Молекулярные маркеры позволяют получать
информацию об изменчивости генов и выявлять
отдельные гены и генные ансамбли, несущие
желательный комплекс признаков

24.

Маркер – это «метка», которая может быть использована
для идентификации определенных генов и локализации
их относительно друг друга
Нет ПЦР продукта
ценный ген
хромосома
ПЦР – продукт определенной длины
хромосома

25.

Преимущества ДНК-маркеров:
-маркирование можно проводить в любой стадии роста, экономя
время, место и ресурсы
-признаки, например устойчивость к болезням могут быть
оценены вне зависимости от наличия инфекции
-ДНК-маркеры выявляют полиморфизм в ДНК, поэтому возможно
исключить влияние окружающей среды на выражение признака
Удобный ДНК-маркер должен обладать следующими признаками:
-должен быть дешевым и легко используемым
- тесно сцеплен с маркируемым признаком
- должен выявлять гетерозиготы (быть кодоминантным)

26.

Маркирование количественных признаков (QTL)
Среди генов, контролирующих молочную продуктивность и
качество молока выделяют группу генов вносящих наибольший
вклад в этот количественный признак:
S1-казеин, -казеин, -лактоглобулин
Аллель – одна из двух (или нескольких) альтернативных
структурных форм гена
Для получения молока, идеального для производства сыра,
необходимо проводить селекцию коров по таким генотипам:
S1 – казеин СС (плотный сгусток)
- казеин ВВ или СС (хорошое сычужное свертывание)
- лактоглобулин ВВ (высокая массовая доля казеина)

27.

Анализ злокачественной гипертермии у свиней
GCGC
CGCG
GCGT
CGCA
C
G
C
G
T
А
C
G
T
А
T
А

28.

Электрофореграмма
Скрытый носитель
Больное животное мутантного гена
Здоровое животное

29.

Паспортизация животных
Паспортизация или соответствие с/х животных тем
или иным породам
Для каждой породы имеется свой набор генетических
маркеров, которые выявляются с помощью ПЦР
1
2
3
4
5
6
1,6 исходные родители
2-5 потомство

30.

Выявление генетических заболеваний на ранних
стадиях развития
Широкий обмен генетическим материалом между разными странами
сопровождается распространением различных инфекционных
заболеваний, а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями,
возникающими у представителей коммерческих пород
У телят голштинской породы недавно обнаружена генетическая
болезнь BLAD – дефецит адгезивности лейкоцитов.
Единственным существующим в настоящее время методом,
позволяющим безошибочно выявить носителей мутантного гена,
является ПЦР-анализ, с последующей рестрикцией.
Установлено, что 15% племенных быков голштинской породы в
Америке является носителем данной мутации.
Ежегодные убытки в результате гибели больных телят составляют
5 млн. долларов

31.

Исследования в молекулярной биологии и генетике
ПЦР широко используется в научных исследованиях.ПЦР
применяется в эволюционной биологии, клонировании
генов, мутагенезе in vitro, изучении структуры геномов и
многих других исследованиях

32. Проверь себя!

1.
Опишите свойства ферментов, которые
осуществляют клонирование ДНК, секвенирование
ДНК, ПЦР и получение кДНК.
2.
Как можно выделить определенную
последовательность ДНК из геномной ДНК?
3.
Фрагмент ДНК имеет следующую
последовательность 3’-GGCGTATTC-5’. Он
отсеквенирован с помощью ферментного метода.
Сколько бэндов всего будет на геле? Сколько
бэндов и каков их размер будет при электорофорезе
в каждой из четырех смесей?

33.

4.
Какие различия между Саузерн-, Нозерн-, Вестерн- и дотблоттингами?
5.
Какие последовательности ДНК содержит библиотека
кДНК?
6.
Можно ли последовательность белка определить с
помощью библиотеки геномной ДНК?
7.
Как иРНК может быть переведена в кДНК?
8.
Будет ли зависеть ПЦР продукт от: а) направленности
праймеров, б) сиквенса праймеров, в) Тm праймеров?