Сeквенирование нуклеиновых кислот

1. Сeквенирование нуклеиновых кислот

2. Метод блуждающего пятна или «Сенгерпринт»

1. Пометить олигонуклеотид по 5’- или 3’концу.
2. Частичный гидролиз олигонуклеотида
соответствующими экзонуклеазами.
3. Электрофорез на ацетате целлюлозы при
рН 3,5
4. Гомохроматографию на DEAE-целлюлозе.
5. Радиоавтография полученной
хроматограммы
6. Расшифровка результатов

3.

ОN + (PNK-T4) + [
32pON
+ svPDE
32P]
ATP
32pON
n 32pON* + pN
Электрофорез на ацетате целлюлозы
в аммоний ацетатном буфере при рН 3,5
+
-
DEAE-целлюлоза

4. Гомохроматография на DEAE-целлюлозе

Частичный гидролизат tРНК
-A
-T
-C
-T
-T
-C
-G
-A
-A
-G
-T
-C
-T
-A
p*NATCTTCAGTA

5. рК оснований

Нуклеотиды
рКа оснований-N
pK1 фосфата
рК2 фосфата
5’-AMP
3.8 (N-1)
0.9
6.1
5’-GMP
9.4 (N-1)
2.4 (N-7)
0.7
6.1
5’-CMP
4.5 (N-3)
0.8
6.3
5’-UMP
9.5 (N-3)
1.0
6.4

6. Протонирование оснований при рН 3,5

NH2
N
+
H
N
H
HO
N
O
OH
N
O
+
N
HO
N
O
pK 3.8
NH2
NH
N
+
N
NH2
HO
H
O
N
O
H3C
O
NH
OH
HO
pK 2.4
OH
N
O
pK 4.5
OH
pK 9.4
O

7.

Общий заряд олигонуклеотида рGATCTTCAGTA и его фрагментов
O
N
NH
O
-
N
O P O
O
N
O
-
+0.01
NH2
NH2
N
+0,5
N
O
O
-
P
N
O
N
O
O
O
H3C
0,0
NH
O
O
-
P
N
O
O
O
NH2
O
+0,8
N
O
O
-
P
N
O
O
O
O
O
H3C
0,0
NH
O
O
-
P
N
O
O
O
O
O
H3C
0,0
NH
O
O
-
P
N
O
O
O
NH2
O
+0,8
N
O
O
-
P
N
O
O
O
NH2
O
N
N
+0,5
O
O
-
P
N
O
N
O
O
O
N
NH
+0.01
O
O
-
P
N
O
N
O
NH2
O
O
0,0
H3C
NH
O
O
-
P
N
O
O
O
NH2
O
+0,5
N
N
O
O
-
P
O
N
O
O
OH
N

8. Определение последовательности нуклеиновых кислот методом Максама - Гилберта

1.
2.
3.
4.
5.
6.
Пометить фрагмент ДНК (РНК) с 5’- или 3’- конца
Провести 4 химические реакции для отщепления
оснований от цепи НК
Расщепить сахарофосфатный остов в местах где
отсутствуют основания
Гель-электрофорез в ПААГ
Радиоавтография
Расшифровка результатов

9. Отщепление пуриновых оснований под действием 60% HCOOH

NH2
N
OR
N
O P O
H
+
N
N
OR
N
N
O P O
O
NH2
N
N
O
O
O P OOR
O P OOR
H
N
N
OR
O
O P O
O-
O-
NH2
H
N
H
+
OH
O-
+
N
O
O
O P OOR
OR
OR
O P O
O P O
OH
O-
N
+
OH
O-
O
O P OOR
OO P OOR
N
+
OO P OOR
CH3
O
OH
N
+
N
+

10. Отщепление гуанина под действием Me2SO4

O
N
NH
N
O
OR P O
O-
N
N
NH2
O
N
NH2
O
O-
N
O P OOR
N
NH2
O
OO
O P OOR
O
OO P OOR
NH
N
+
NH2
OH
N
+
OR
O P O
O
HN
O
OR P O
O P OOR
H3C
N
O
H2N
OH
NH
O
O
O P OOR
O P O
NH
O-
O
OR
N
+
N
O
OR P O
O
H 3C
O
H 3C
OH
O-
OO P OOR
N
+
CH3
O
N
+

11. Отщепление тимина под действием гидразина

NH
N
P O
NH
OR
O
N
O
OO
N
H
OR
O
P O
HN
HN
O
O
O
NH2
NH
H2N
OR
O
O
O
O
P O
N
O
O
O
OR
O
O P OOR
OH
P O
O-
O-
NH2
N
H
O
N
O-
O
O
O
O P O-
O P O-
O P O-
OR
OR
OR
OR
O
P O
OH
O-
N
+
O-
O
OR
O P O-
O P OOR
O
P O
OH
N
O-
+
OH
N
+
OR
CH3
OO P OOR
O
N
+

12. Отщепление цитозина под действием гидразина в присутствии 2М NaCl

NH2
N
N
P O
O
O
O-
NH
OR
O
O
HN
O
O
P O
O
O
OR
O P O-
P O
N
O
OR
O
O
NH2
N
H
OH
P O
O-
O-
O P O-
N
N
H
OR
N
H2N
H2N
NH
H2N
OR
O
HN
NH
O
N
O-
O
O
O P O-
O P OOR
OR
OR
OR
O
P O
OH
O-
N
O-
+
O P O-
O
OH
N
+
OR
OR
O P OOR
O
P O
OH
N
O-
+
CH3
OO P OOR
O
N
+

13. Общая схема проведения секвенирования по Максаму - Гилберту

5’ – GATCGCTATACGAGAATTCAGCTCGA - 3’
3’ – CTAGCGATATGCTCTTAAGTCGAGCT - 5’
Т4-полинуклеотидкиназа, γ-АТФ
5’-*pGATCGCTATACGAGAATTCAGCTCGA - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAAGTCGAGCTp*-5’
Рестриктаза EcoR I
5’-*pGATCGCTATACGAGAATTCAGCTCGA
5’-*pGATCGCTATACGAG
AATTCAGCTCGA- -3’3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAAGTCGAGCTp*-5’
CTAGCGATATGCTCTTAA GTCGAGCTp*-5’
Разделение фрагментов
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’- AATTCAGCTCGA - 3’
3’ - GTCGAGCTp*-5’

14.

5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
Химическая модификация
по Максаму-Гилберту
Me2SO4
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
H+
NH2-NH2
NH2-NH2 +NaCl
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTA A -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’ 3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’
5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’
3’ - CTAGCGATATGCTCTTAA -5’

15. 5’-*pGATCGCTATACGAG - 3’

G
*pGATCGCTATACGA
*pGATCGCTATAC
*pGATC
*p
A+G
*pGATCGCTATACGA
*pGATCGCTATACG
*pGATCGCTATAC
*pGATCGCTAT
*pGATCGCT
*pGATC
*pG
*p
T+C
*pGATCGCTATA
*pGATCGCTA
*pGATCGC
*pGATCG
*pGAT
*pGA
C
*pGATCGCTATA
*pGATCG
*pGAT

16.

G
3’-
5’-
G
A
G
C
A
T
A
T
C
G
C
T
A
G
G+A
T+C
C