Біохімічна відповідь олігодендроцитів до ішемічного стану

1. Дипломна робота магістра БІОХІМІЧНА ВІДПОВІДЬ ОЛІГОДЕНДРОЦИТІВ ДО ІШЕМІЧНОГО СТАНУ

Міністерство освіти і науки України
Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара
Факультет біології, екології та медицини
Кафедра біофізики та біохімії
Дипломна робота магістра
Б І ОХ І М І Ч Н А В І Д П О В І Д Ь ОЛ І ГОД Е Н Д Р О Ц И Т І В
Д О І Ш Е М І Ч Н О ГО С ТА Н У
Виконавець:
студент гр. БХ-14м
Жданкін А. Є.
Наук. керівник:
зав. каф. біофізики та біохімії, д.б.н.,
проф. Ушакова Г. О.
ДНІПРОПЕТРОВСЬК
2015

2. Актуальність роботи

Мієлінова оболонка – це ліпідно-білковий комплекс, утворений мембранами
олігодендроцитів, сконцентрованих навколо нервових волокон. Ішемічний стан
нервової системи в цілому порушує структуру мієліну. На
сьогодні не повністю з’ясований вплив ішемії на стан мієліну. Тому
важливим кроком є вивчення біохімічних змін олігодендроглії за умов ішемії.
Рис. 1. Мієлінова оболонка аксонів
(http://pixx4fun.com)
Рис. 2. Олігодендроцит
(http://compulenta.computerra.ru)

3. МЕТА РОБОТИ

Мета роботи: вивчити стан мієлінової оболонки в головному мозку
ссавців на початкових етапах постнатального розвитку; оцінити
біохімічну відповідь олігодендроглії до ішемічного стану мозку
ЗАВДАННЯ РОБОТИ:
• проаналізувати літературні дані, в яких розглядається біохімічна відповідь
олігодендроцитів за умов ішемічного ушкодження мозку гризунів;
• визначити кількісні показники основного білка мієліну та загального
протеїну у різних відділах головного мозку щурів на ранніх етапах
постнатального розвитку;
• оцінити рівень загального протеїну та основного білка мієліну за
ішемічного стану мозку гризунів та при введенні терапевтичних
препаратів – Корвітину та альфа-кетоглутарату.

4. Основний білок мієліну

Основний білок мієліну (myelin basic protein, ОБМ) – специфічний білковий
компонент мієлінових мембран (на його частку припадає приблизно 50%
білків мієліну). Втрата білка призводить до перешкоди мієлінізації, оскільки
зниження рівня його експресії в тканинах мозку відображає тяжкість
ушкодження ЦНС. Експерименти на тваринах довели, що в головному мозку
дорослих щурів транскрибується значна кількість ОБМ мРНК, в той час як
мінімум експресії білка припадає на ранній постнатальний розвиток.
Рис. 3. Мієлінова оболонка
(https:// medicalxpress.com)
Рис. 4. Експресія ОБМ у гіпокампі
гризунів (позначено червоним) (info-svit.org.ua)

5. Ішемія головного мозку

Ішемія головного мозку (Ішемічна хвороба) – патологічний процес обумовлений
недостатнім кровообігом окремих ділянок головного мозку внаслідок
ослаблення припливу крові. Мозкова тканина відчуває гостре кисневе
голодування, у результаті чого окремі її зони перетворюються на осередки
некрозу.
Ішемія головного
мозку
Фокальна
(локальна)
Глобальна
Незворотна, наростаюча,
транзиторна
Рис. 5. Ішемія головного мозку
(http://nebolet.com.ua/)

6.

ОБ’ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ
У дослідженнях використовували:
• для визначення ОБМ та загального протеїну у ранньому постнатальному
розвитку: мозок 18 білих щурів лінії ВІСТАР, розподілених на три групи (n =
6): 1 – одноденні особини (4–6 г), 2 – одномісячні (45–60 г) і 3 – тримісячні
тварини (50–100 г);
• для визначення
білків за умов ішемічного стану мозку: мозок 24
шестимісячних щурів вагою 150–200 г, розподілених на 4 групи (n = 6): 1 –
контрольна група; 2 – Ішемія (ішемічна група); 3 – Ішемія + Корвітин (К); 4
– Ішемія + альфа-кетоглутарат (α-КГ).

7.

Ізадрин-пітуїтринова модель ішемії
18 тваринам вводили: пітуїтрин (двічі на добу, внутрішньочеревинно, 0,2 мл
на 1 тварину) + ізадрин (тричі на добу, підшкірно, 0,4 мл на 1 тварину)
Першу і другу групи вивели з експерименту після завершення
препаратів.
Тварин 3 групи лікували Корвітином (Борщагівський хім-фарм. завод,
Україна) протягом 5 діб (по 0,42 мл на 1 тварину): 1 день – три введення: 1-ше
і 2-ге – з інтервалом 2 год, 2-ге і 3-тє – з інтервалом 12 год; 2-3 дні – по два
введення з інтервалом 12 год; 4-5 дні – 1 введення.
Тварин 4 групи лікували альфа-Кетоглутаратом (1%-й розчин) протягом 6
днів (перорально).
Ізадрину гідрохлорид
(Isadrinum hydrochloride)
Корвітин (Кверцетин)
(Corvitin)
ін’єкцій
альфа-Кетоглутарат
(Alpha-ketoglutaric acid)

8. Методи дослідження

Тварин декапітували під слабким ізофлурановим наркозом, з
мозку виділяли відділи: мозочок, кору великих півкуль, таламус та гіпокамп.
Екстракція білків з
відділів мозку
Диференціальне центрифугування: отримання
мембранної фракцій білків
(Fomenko et al., 2011)
(Fomenko et al., 2011)
Статистична обробка
отриманих даних
(Лакин, 1990)
Непрямий ІФА
(Bullock G. R., Petrusz Р., 1985);
(Fomenko et al., 2011)

9.

Вміст ОБМ у головному мозку щурів різних вікових груп
6
1 день
1 місяць
3 місяці
мкг/100 мг тканини
5
4
*
3
*
2
1
0
Мозочок
Гіпокамп
Таламус
Відділи головного мозку
n = 6; *р<0,05 відносно 1-місячних тварин

10.

Вміст загального протеїну головному мозку щурів різних
вікових груп
1,4
1,2
1 день
*
1 місяць
*
3 місяці
мг/мл
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Мозочок
Таламус
Гіпокамп
Відділи головного мозку
n = 6; *р<0,05 відносно 1-денних тварин

11.

Вміст основного білка мієліну у мозочку щурів за умов ішемії
160
Мозочок
мкг/100 мг тканини
140
120
*
100
*
80
*#
60
40
20
0
Контроль
Ішемія
Ішемія + К Ішемія + α-КГ
Групи тварин
n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

12.

Вміст основного білка мієліну у корі великих півкуль мозку щурів
за умов ішемії
Кора
мкг/100 мг тканини
120
100
*
*#
80
60
40
20
0
Контроль
Ішемія
Ішемія + К
Ішемія + α-КГ
Групи тварин
n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

13.

Вміст основного білка мієліну у таламусі щурів за умов ішемії
120
Таламус
мкг/100 мг тканини
100
80
*#
60
*
*
Ішемія
Ішемія + К
40
20
0
Контроль
Ішемія + α-КГ
Групи тварин
n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

14.

Вміст основного білка мієліну у гіпокампі щурів за умов ішемії
120
Гіпокамп
мкг/100 мг тканини
100
80
*
*
*
60
40
20
0
Контроль
Ішемія
Ішемія + К Ішемія + α-КГ
Групи тварин
n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

15. Вміст загального протеїну у мозочку щурів за умов ішемії

Мозочок
2
1,5
мг/мл
*#
1
0,5
0
Контроль
Ішемія
Ішемія +
Корвітин
Ішемія + α-КГ
Групи тварин
n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

16.

Вміст загального протеїну в корі великих півкуль мозку
щурів за умов ішемії
2
Кора
*
мг/мл
1,5
#
1
*#
0,5
0
Контроль
Ішемія
Ішемія +
Корвітин
Ішемія + α-КГ
Групи тварин
n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

17.

Вміст загального протеїну в таламусі щурів за умов ішемії
2
Таламус
1,5
*
мг/мл
*
*#
1
0,5
0
Контроль
Ішемія
Ішемія +
Корвітин
Ішемія + α-КГ
Групи тварин
n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

18.

Вміст загального протеїну у гіпокампі щурів за умов ішемії
3
Гіпокамп
2,5
мг/мл
2
*
*#
1,5
*#
1
0,5
0
Контроль
Ішемія
Ішемія +
Корвітин
Ішемія + α-КГ
Групи тварин
n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

19.

ВИСНОВКИ
В мозку новонароджених щурів процеси мієлінізації нервових волокон
розпочинаються лише після народження. Рівень ОБМ та ЗП у цей період мінімальний.
Вміст ОБМ у гіпокампі 1-місячних щурів нижчий в 3-4 рази, ніж у 3-місячних.
Нерівномірне збільшення ОБМ пояснюється інтенсивною мієлінізацією нервових
волокон гіпокампу. У розподілі загального протеїну не виявлено достовірних змін.
1.
2. У таламусі не спостерігається великих варіацій у концентрації ОБМ зі збільшенням
віку тварин. Вміст загального протеїну збільшується до 1-місяця, проте між 1- та 3місячними тваринами спостерігаються незначні коливання ЗП. Концентрація ОБМ у
мозочку 1-місячних особин є найвищою серед піддослідних тварин. Починаючи з
цього терміну, інтенсивність мієлінізації знижується приблизно на 32,4%, що пов'язано
з частковою демієлінізацією аксонів мозочка. Концентрація загального протеїну у
мозочку зростає зі збільшенням віку тварин.
3. За умов глобальної ішемії у всіх відділах головного мозку, окрім кори великих
півкуль, знижується вміст загального протеїну та основного білка мієліну, що свідчить
про демієлінізацію нервових волокон та зниження функціональної активності
олігодендроглії.
4. Нейропротекторні препарати Корвітин та альфа-кетоглутарат не повністю
відновлюють уражені ішемією ділянки головного мозку. Альфа-кетоглутарат виявляє
позитивний терапевтичний ефект у мозочку, корі великих півкуль і таламусі. Корвітин
чинить відновлюючий ефект лише у таламусі.

20.

Слава Україні – героям слава!!!
ДЯКУЮ ЗА
УВАГУ!!!

21. Перелік робіт, опублікованих за досліджуваною темою:

1. Жданкін, А. Є. Вміст основного білка мієліну у головному мозку щурів під час раннього
постнатального розвитку / А. Є. Жданкін, Ю. П. Ковальчук, Г. О. Ушакова // Сучасні проблеми
викладання та наукових досліджень біології у ВНЗ України: матеріали Ι Всеукраїнської
науково-практичної конференції молодих вчених та студентів з міжнародною участю. –
Дніпропетровськ: Вид-во ДНУ, 2014. – С. 19–20.
2. Жданкін, А. Є. Вивчення кількісних показників основного білка мієліну як специфічного
маркеру вікових змін мієлінової оболонки головного мозку гризунів / А. Є. Жданкін //
Всеукраїнський конкурс студентських наукових робіт з біологічних наук: зб. тез доп. підсум.
наук.-практ. конф. (24-26 березня 2015 року) / Відп. за вип. І.О. Шмараков. – Чернівці:
Чернівецький нац. ун-т, 2015. – С. 38–40.
3. Жданкін, А. Є. До питання про вплив церебральної ішемії на експресію основного білка
мієліну у головному мозку щурів / А. Є. Жданкін // Молодь і поступ біології: збірник тез ХI
Міжнародної науково-практичної конференції студентів і аспірантів (м. Львів, 20–23 квітня
2015 р.). – Львів : СПОЛОМ, 2015. – С. 63–64.
4. Жданкін, А. Є. Короткотривалий вплив адреналіну на рівень білків S-100b та NCAM у різних
відділах головного мозку щурів // А. Є. Жданкін, О. О. Довбань, Ю. П. Ковальчук, Г. О.
Ушакова // Тези доповідей III міжнародного форуму студентів, аспірантів і молодих учених/
ред. кол.: М.В. Поляков (голова) та ін. – Дніпропетровськ: ДНУ, 2015. – С. 377–379.
5. Ушакова Г. А., Жданкин А. Е. Основной белок миелина: структура, свойства, изоформы и
посттрансляционные модификации // APRIORI. Серия: Естественные и технические науки
[Электронный ресурс]. 2014. № 6. С. 1–11.
6. Koval’chuk, Yu. P. Aging-Related Peculiarities of the Distribution of Myelin Basic Protein in
Cerebral Structures of Gerbils / Yu. P. Koval’chuk, A. Ye. Zhdankin, G. O. Ushakova //
Neurophysiology. – 2015. – Vol. 47. – № 2. – Р. 165–167.