Молекулярно-генетические методы исследований генома. Современные методы диагностики и профилактики наследственных болезней

1. Лекции № 26-28

Тема: Молекулярно-генетические
методы исследований генома
Современные методы диагностики
и профилактики наследственных
болезней

2. План лекции:

1. Методы рестрикционного и ПЦР-анализа
ДНК .
2. Методы клонирования и секвенирования
последовательностей ДНК.

3. Основные этапы молекулярного анализа

• Выделение молекулы ДНК в чистом виде
• Фрагментация молекулы ДНК
• Амплификация (получение большого
количества копий)фрагментов ДНК.
• Секвенирование (определение
нуклеотидной последовательности
фрагментов ДНК
• Выяснение структурной организации и
функциональной роли отдельных участков
гена и др. последовательностей ДНК

4.

• ДНК может быть выделена из любого
биологического материала, различных
типов тканей и клеток, содержащих ядро.
• В научных целях ДНК может быть получена
методом химического синтеза, причем рост
цепи идет с 5‘-конца, а не с 3‘-конца.
Полученные фрагменты используются в
качестве праймеров для амплификации и
секвенирования ДНК, также для сайтспецифического мутагенеза и в качестве
зондов при гибридизации и линкеров,
облегчающих клонирование

5.

Современные генетические технологии и методы

6.

Получение серии перекрывающихся фрагментов с одинаковыми «липкими» концами при
обработке части сайтов рестрикции ДНК

7. Специфическое расщепление ДНК рестриктазами

8. Метод полиморфизма длины рестриктазных фрагментов (ПДРФ)

Определение
отцовства с
помощью метода
ПДРФ

9.

Методика блот-гибридизации. а – блот-гибридизация по Саузерну; б – дот-гибридизация;
в – слот-гибридизация.

10. Метод блот- гибридизации (Саузерн-блот) (Э.Саузерн, 1975 г.)

11. Амплификация ДНК

12.

Механизм ПЦР

13.

В настоящее время в практическое здравоохранение
внедряется новая технология ПЦР — ПЦР в реальном
времени (ПЦР-РВ, Real-Time PCR). Ее принципиальной
особенностью является мониторинг и количественный
анализ накопления продуктов полимеразной цепной
реакции, а также автоматическая регистрация и
интерпретация полученных результатов. Этот метод не
требует стадии электрофореза, что позволяет снизить
требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории.
Благодаря экономии производственных площадей,
уменьшению количества персонала и востребованности
количественного определения ДНК/РНК этот метод в
последние годы успешно применяется в крупнейших
санитарно-эпидемических, диагностических и научноисследовательских центрах развитых стран мира,
замещая ПЦР в ее сегодняшнем («классическом»)
формате.

14.

Более высокой специфичности детекции результатов
ПЦР в режиме реального времени можно достигнуть за
счет наличия в реакционной смеси дополнительного
олигонуклеотида - гибридизационного зонда. Такой зонд
"отжигается" (комплементарно соединяется с ДНК) на
участке ампликона между прямым и обратным
праймером.
На
разных
концах
зонда
расположены флуорофор и тушитель флуоресценции
этого красителя. Когда флуорофор и тушитель связаны с
олигонуклеотидным
зондом,
наблюдается
лишь
незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время
процесса амплификации за счет 5`-экзонуклеазной
активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка
переходит в раствор, освобождаясь от соседства с
тушителем и генерирует флуоресцентный сигнал,
усиливающийся в реальном времени пропорционально
накоплению амплификата

15.

Существует два основных подхода к детекции результатов ПЦР в
реальном времени: с помощью интеркалирующих красителей и на
основе флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов.

16.

В случае если используемые праймеры "отожгутся" на
неспецифических участках с образованием в ходе ПЦР-РВ
"нецелевого" продукта, то его последовательность не будет
иметь участок, комплементарный гибридизационному зонду
и, соответственно, "нецелевые" ампликоны не будут
регистрироваться как целевые. При этом для такого
варианта ПЦР-РВ можно одновременно использовать
несколько видов красителей и гасителей их флуоресценции
(с
неперекрывающими
спектрами
излучения).
Это
позволяет осуществлять мультиплексную ПЦР.

17.

Низкоспецифичная детекция результатов ПЦР-РВ с
помощью интеркалирующих красителей
Детекция продуктов амплификации возможна за счет
увеличения флуоресценции интеркалирующего красителя
при образовании комплекса с двуцепочечной ДНК. Самый
популярный краситель на сегодняшний день - SYBR Green
I. Это чувствительный флуоресцентный индикатор
двухцепочечной ДНК. Максимум флуоресценции в
комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум
возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм).
Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером.
Квантовый выход флуоресценции - около 0.8 (что в 5 раз
превышает квантовый выход комплекса этидий-ДНК).

18. Мультипраймерная (мультиплексная) ПЦР

• Мультиплексная ПЦР, мультипраймерная ПЦР
(multiplex PCR, multiprimer PCR, лат. multum — много
и plex — складка, сгиб) - ПЦР, в которой одновременно
используют более одной пары олигонуклеотидных
праймеров, что приводит к коамплификации
нескольких ДНК-матриц. Такая реакция позволяет
экономить время, она широко используется для
экспресс-идентификации инфекционных агентов,
напр. скрининга сразу по нескольким инфекционным
возбудителям, или для исследования состояния
нескольких аллельных генов у эукариотических
организмов.

19. Мультиплексная ПЦР

Мультиплексная ПЦР
образцов ДНК
больных
Миодистрофией
Дюшенна (1—4)
и здорового донора(К)

20. AmpFlSTR™ Profiler ДНК, выделенная из различных тканей

21.

Процесс получения комплементарной ДНК (к ДНК) (Russell, 1998)

22. Одновременная детекция экспрессии несколько генов

23.

24.

Клонирование фрагментов к ДНК с использованием линкеров, содержащих сайт
рестрикции (Russell, 1998)

25.

Образование двойной спирали к ДНК

26. Результаты технологии клонирования

27.

Этапы клонирования фрагмента ДНК с использованием плазмидного
вектора

28. Секвенирование ДНК(Ф.Сингэр) «Дидезоксиметод»

29.

Секвенирование ДНК а- этапы дидезоксисеквенирования по методу Сангера;
б- автоматическое дидезоксисеквенирование

30.

Метод прогулки по хромосоме

31.

Секвенирование методом «праймер-опосредованной прогулки» («блуждающей затравки)

32.

33.

34.

Кариотип больного с реципрокной транслокацией t2p;14q при
использовании мультиплексной FISH.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42. Гены-активаторы транскрипции в эволюционной линии человека сильно амплифицированы

43.

44.

ПЦР в реальном времени
Амплификатор в режиме реального времени Agilent
Stratagene MX3005P
Амплификатор в режиме реального времени Agilent
Stratagene MX3000P
Амплификатор для количественной ПЦР Agilent Aria
MX
Лабораторное оборудование Stratagene для ПЦР
Прибор для ПЦР в реальном времени АНК-32-М
Система ПЦР в реальном времени Applied Biosystems
7500
Термоциклер для ПЦР в реальном времени PikoReal
Термоциклер для ПЦР в реальном времени TOptical
Экспресс-амплификатор в режиме реального времени
АНК-4

45.

46. 24-цветная флуоресцентная гибиридизация in situ (M-FISH)

47. Спектериальное кариотипирование (SKY)

48. Молекулярно-генетические методы исследования в судебной медицине

49.

50.

51. Этногеномика (Kring M., Stone A., Schmitz R. W. et al.1997)

52. Изучение этнической истории популяций Азии и Европы ( Г.М.Березина, Г.С. Святова, А.М. Абдуллаева,1997)

53. Литература:

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. М.,
1988.
2. Бочков Н.П. Клиническая генетика. М., 2006.
3. Генетика. Под ред. Иванова В.И. М., 2006.
4. Гинтер Е.К. Медицинская генетика. М., 2003.
5. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика.
Новосибирск, 2006.
6. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции.
М., 1989.
7. Медицинская биология и генетика. Под ред. проф.
Куандыкова Е.У. Алматы, 2004.

54. Контрольные вопросы (обратная связь):

1. Современные методы диагностики и
профилактики наследственных болезней.