Современные методы ДНК-диагностики наследственных болезней

1. Современные методы ДНК-диагностики наследственных болезней

Современные методы ДНКдиагностики наследственных
болезней
Выполнил: студент 1 курса,
факультета ОМ
Группы 028-2
Нишанбаев Бахром

2. План

Введение
Молекулярно-генетические метод
ДНК-диагностика
Типы ДНК-диагностики
Методы ДНК-диагностики
Диагностика с использованием метода Fluorescence in
situ Hybridization (FISH)
Метод FISH-диагностики
Полимеразная цепная реакция
Стадии ПЦР
ДНК-секвенирование
Заключение
Список использованной литературы

3. Введение

Нынешний мир это место, где день ото дня люди открывают что-то новое, пытаются
изучить то, что ещё не изведано, излечить те болезни, которые сегодня считаются
неизлечимыми. И сейчас, когда люди способны добраться и изучить даже самые
мельчайшие частички человеческого организма, изучение, предсказание и борьба со
многими серьезными болезнями становится осуществимой. Сегодня большое
распространение имеют различные наследственные заболевания. Так, например, сейчас
уже каждый 3-4 ребенок из 100 родившихся имеет определенные врожденные аномалии, а
каждый здоровый человек может являться носителем до 5-7 наследственных патологий.
Проблема наследственных болезней как никогда актуальна в нынешнем мире поэтому с
ней нужно активно бороться. И как решение, сейчас существуют методы ДНКдиагностики, которые позволяют узнать о возможных болезнях и заранее начать борьбу с
ними.

4. Молекулярно-генетические метод

• Это большая и
разнообразная группа
методов, позволяющих
выявить различные
вариации в структуре
ДНК, вплоть до
расшировки первичной
последовательности
нуклеоидов.

5. ДНК-диагностика

• ДНК-диагностика
—
это
один
из
наиболее
современных
высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко
применяются в диагностике инфекционных,
наследственных и прочих
заболеваний. Совокупность всех методов и технологий ДНК-диагностики
позволяет выявлять повреждения в определенном гене человека, которое и
является причиной болезни.

6. Типы ДНК-диагностики

• Прямая
Определение мутации, являющейся непосредственной причиной заболевания
При прямой диагностике обнаруживают мутации клонированного гена
Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %
Показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия, муковисцидоз, хорея Гентингтона и другие
• Косвенная
Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе
Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в тех случаях, когда при наследственных
заболеваниях ген не клонирован или заболевания сопровождается повреждением различных
генов, либо молекулярная организация гена не позволяет использовать прямые методы.
Точность косвенной диагностики значительно меньше, чем прямой диагностики

7. Методы ДНК-диагностики

• Во время диагностики цепи ДНК могут выявляться различные нарушения и для изучения
каждого из них применяют различные методы исследования. Основными видами
хромосомных повреждений являются делеции, дупликации, инверсии и транслокации. Для
их исследования применяют цитогенетические (кариотипирование) или молекулярноцитогенетические (флуоресцентная гибридизация in situ, сравнительная геномная
гибридизация) методы. Для выявления точковых мутаций используют ПЦР с последующим
ДНК-секвенированием.

8. Цитогенетический метод

• С помощью данного метода можно изучать
наследственный материал клетки: совокупность
хромосом в целом (кариотипирование) или
наличие и количество Х-хромосом (определение
полового хроматина — число глыбок полового
хроматина или телец Барра). Исследование
проводится с помощью светового микроскопа.
При пренатальной диагностики данный метод
позволяет
выявить
наиболее
часто
встречающиеся хромосомные болезни (синдром
Дауна, синдром Патау, синдром Эдвардса,
синдром Клайнфельтера, синдром Орбели и
прочие)

9.

10.

11. Методы идентификации мутаций генов наследственных болезней

• К методам идентификации мутаций генов наследственных болезней
относятся:
-идентификация известных мутаций,
-идентификация невыявленных мутаций,
-идентификация мутаций и генетических полиморфизмов.

12. Диагностика с использованием метода Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

• Классический метод FISH-анализа основан
на
гибридизации
известной
по
нуклеотидному составу ДНК-пробы с
участком тестируемой хромосомы и
последующим выявлением результата
гибридизации по метке – флуоресцентному
сигналу в ожидаемом участке. В качестве
ДНК-пробы (ДНК-зонда) могут служить
относительно небольшие фрагменты ДНК,
комплементарные
анализируемой
последовательности хромосомной ДНК
(мишени) больного.

13. Метод FISH-диагностики

FISH анализ осуществляется в несколько этапов:
• получение препаратов и их пред подготовка;
• мечение ДНК-пробы;
• -гибридизация с ДНК-пробой, то есть собственно технология FISH:
-денатурация препаратов;
-денатурация ДНК-проб;
-процедура гибридизации;
-окраска препаратов;
• детекция ДНК-зонда при микроскопическом анализе

14. Полимеразная цепная реакция

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной
биологии, позволяющий добиться значительного
увеличения малых
концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в
биологическом материале (пробе).

15. Стадии ПЦР

1.
2.
3.
Денатурация – переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при разрыве
водо- родных связей между комплементарными парами оснований под
воздействием высоких температур
Отжиг - присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры
подбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны
противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом
комплементарности Чаргаффа.
Элонгация (синтез) - после отжига праймеров Taq-полимераза начинает
достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера

16.

17. ДНК-секвенирование

• Вплоть до настоящего времени «золотым
стандартом»
ДНК-диагностики
остается
традиционное секвенирование. Принцип этого
метода был разработан Ф.Сэнгером в конце 1970-х
годов
и
подразумевает
использование
модифицированных
нуклеотидов
–
дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ddNTP) или
терминаторов.
Наиболее
распространенным
методом анализа нуклеотидной последовательности
является
секвенирование
с
использованием
капиллярных генетических анализаторов
Фредерик Сэнгер

18. ДНК-секвенирование

1.
2.
3.
4.
5.
6.
Производится ПЦР-амплификация фрагмента ДНК
К полученному продукту добавляют прямой или обратный праймер и ДНКполимеразу.
В ходе реакции ДНК-полимераза встраивает в растущую цепь ДНК терминирующий
нуклеотид, который прекращает синтез после соответствующего нуклеотида.
Образуется большое число фрагментов ДНК, отличающихся по длине на один
нуклеотид
Фрагменты ДНК движутся в тонком капилляре, заполненном полиакриламидным
гелем, и разделяются в соответствии с их длиной.
Флуоресцентный сигнал от каждого терминирующего нуклеотида детектируется с
помощью лазера и преобразуется в хроматограмму, где каждый нуклеотид
представлен в виде пика соответствующего цвета (красный, синий, зеленый, черный).

19. Принцип капиллярного секвенирования по Сэнгеру

20. Секвенирование нового поколения (NGS)

• Новые технологии секвенирования позволяют избавиться от главного недостатка метода
Сэнглера, а именно низкой пропускной способности. Технологии NGS позволяют
одновременно, параллельно секвенировать тысячи коротких фрагментов ДНК. Принцип NGS
основан на параллельном сегментировании специальным образом подготовленных
однонитевых библиотек фрагментированной ДНК исследуемых образцов. Технология NGS
включает в себя: подготовку библиотек (фрагмент ДНК до 300-500 нуклеотидов),
секвенирование и анализ полученных данных.

21. Секвенирование нового поколения (NGS)

• Несмотря на свою недолгую историю,
секвенирование нового поколения хорошо
зарекомендовало себя в качестве мощного
инструмента
медицинской
генетики,
позволив обнаружить гены, причастные к
развитию многих редких заболеваний. В
частности, за последние несколько лет при
помощи
массивного
параллельного
секвенирования были открыты генетические
причины ряда синдромов (Кабуки, Миллера,
Фаулера, Сенсенбреннера и т.д.).
Прибор для полногеномного
секвенирования HiSeq2000 фирмы
Illumina

22. Заключение

На сегодняшний день, технологии уже позволяют выявлять множество болезней при
помощи методов ДНК-диагностики. И существует уже несколько методов, которые
позволяют это сделать. С каждым годом, человечество все ближе и ближе приближается к
тому, чтобы за крайне быстрые сроки определять существование болезни в организме
человека или же предсказывать возможность заболевания. Сегодня ученые уже обладают
методиками и оборудованиям для выявления болезней, однако затраты времени и денег
на диагностику и обследование остаются ещё довольно большими. Однако, если
развиваться в том же направлении, то уже в ближайшем будущем каждому человеку будут
доступны методы при помощи которых он сможет узнать, какие возможные
наследственные и прочие заболевания могут нести угрозу для него и для его следующих
поколений.

23. Список использованной литературы

• «Медицинская биология и генетика» Учебное пособие для студентов
медицинских вузов под редакцией Куандыкова Е.У.- Алматы 2004 г
• «Традиционные методы ДНК-диагностики генных мутаций»
В.В.Стрельников, Н.И. Пирогова, 2016г. http://genschool.ru/wadata/public/site/1.5_Tradits_metody_StrelnikovVV.pdf
• «Применение молекулярних технологий нового поколения в
медицинской генетике», Е.Н.Суспицын, А.П.Соколенко, 2013г
https://gpma.ru/structure/chair/med_gen/prim_moltech.pdf
• Методы молекулярно-генетической диагностики сегодня. Никоненко
Т.А., 2008г.http://www.ramld.ru/articles/files/nikonenkoLM9.pdf
• Fluorescence in situ hybridisation (FISH). Unique, 2013г.
http://www.rarechromo.org/information/Other/FISH%20FTNW.pdf
• http://yamedik.org/?p=61&c=biologiya/bio_gen_myt