Создание штаммов микроорганизмов для биотехнологии

1.

Создание штаммов
микроорганизмов
для биотехнологии
Дебабов
Владимир Георгиевич
[email protected]

2.

Escherichia coli :
потенциал для биотехнологии
Источники питания:
глюкоза
аммиак
фосфаты
сульфаты
Время удвоения –
30 мин
Продукты клетки:
4 291 генов
900 метаболитов
2 350 000 молекул белка
1014 – 1016 реакционных событий

3.

Схема традиционной ступенчатой селекции
CSI - classical strain improvement / CSS - classical strain selection
Исходный штамм
рост
Популяция
обработка мутагеном
Мутантная популяция
отбор
I
II
III
повторение цикла
- штаммы с повышенной продуктивностью
- штамм с наивысшей продуктивностью
I, II, III - разные линии селекции

4.

Селекция продуцентов антибиотика тилозина
Streptomyces fradie
CSS - метод (20 циклов мутагенеза и отбора)
SF1
SF2
Мутагены (HNO2, УФ, нитрогуанидин)
натуральная селекция
1,0 ± 0,1 г/л
6,2 ± 1,2 г/л
20 лет; 1 миллион тестов
Геномный шафлинг (GS)
SF1
Исходный
штамм
рост
мутагенез селекция
рост
1 год; 24 тысячи тестов
Результат:
GS1: 8,1 ± 1,2 г/л
рекомби- селекция
нация
повторение
цикла
Nature (2002) 415, 644-646

5.

Робот для селекции микроорганизмов
в ГосНИИгенетика

6.

Робот для селекции микроорганизмов
в ГосНИИгенетика

7.

Условия применимости
метаболической инженерии
Знание цели, т.е. какой ген(ы) надо ввести
в организм, или какой ген надо инактивировать,
изменить регуляцию и т.д.
Обладание способами генетического обмена
и конструирования
Владение методами оценки результатов
генетических изменений на фенотипическом
уровне

8.

Инструментарий метаболической инженерии :
Рекомбинационная инженерия. Делеция гена

9.

Инструментарий метаболической инженерии :
Рекомбинационная инженерия. Оптимизация экспресии

10.

Инструментарий метаболической инженерии :
Оптимизация экспресии. Библиотеки промоторов и RBS

11.

Оптимизация структуры искусственных оперонов .
Обеспечение реинициации трансляции

12.

13.

14.

15.

Циклы метаболической инженерии
- генетическая инженерия
- методы генетического обмена
Базовый
штамм
Генетические
модификации
Штаммы
I, II, III
поколений
Анализ
фенотипа
Источник
генов
-
концентрация метаболитов
активность ферментов
физиологические параметры
транскриптомика
протеомика
метаболомика
анализ метаболических потоков
математические модели

16.

Гены из природных биотопов
Коллекция образцов
из окружающей среды
«Биотопы»
Изоляция ДНК
Environmental – DNA e
Клонирование
в хорошо изученный вид
микроорганизмов (Библиотека
генов - Environmental libraries)
Переклонирование
в разные виды для
оптимизации экспрессии
( E. coli, S. lividans, P. putida )
Скрининг активностей

17.

Биосинтез гидрокортизона
в дрожжах Saccharomyces cerevisiae
Глюкоза
1
Эргостерин
2
Прогестерон
3
Гидрокортизон
1. Оптимизация синтеза эргостерина в дрожжах;
2. Трансформация в прогестерон
(введение двух генов растений и двух генов животных);
3. Превращение прогестерона в гидрокортизон
(введение двух генов человека и четырех генов быка).

18.

В ГосНИИгенетика созданы
лучшие в Мире
биотехнологии получения
L - Треонина
Рибофлавина
Акриламида
Эти биотехнологии используются
ведущими биотехнологическими фирмами Мира.

19.

Подходы: продуценты метаболитов
1.
Выбор штамма и метаболического пути синтеза;
2.
Оптимизация транспорта субстрата в клетку;
3.
Оптимизация метаболического пути и синтеза
необходимых кофакторов;
4.
Блокирование боковых путей;
5.
Оптимизация транспорта метаболита из клетки;
6.
Инактивация транспорта метаболита в клетку;
7.
Оптимизация свойств ключевых ферментов;
8.
Тонкая настройка экспрессии ключевых генов;
9.
Оптимизация продукции в ферментере.

20.

Биосинтез аминокислот аспарагинового семейства
ASP
ATP
ADP
thrA, metL, lysC
ASP - β - P
LYS
NADPH + H +
asd
+
NADP
ASP - semialdehyde
NADPH + H +
thrA, metL
NADP +
Homoserine
MET
thrB
Homoserine - P
thrC
tdh
Threonine
2 - amino - 3 - ketobutyrate
ilvA, tdcB
α - ketobutyrate
ILE

21.

lamB
ompC
xylE
amtB
ompF
galP
ptsG
-
AMP Glu
Gln ATP
H+
Gln
NADPH
Glucose
NH4+
gltBD
ybiV
glnA
Asn
asnB
AMP
ATP
NH4+
NADPH NH4
α-KG
asnA
+
ATP
Glu
gdhA
glgC
Glycogen
G-6-P
otsA
Trehalose
nadB
aspC
Asp-P
NADPH
asd
yahN
Lys
H
+
rhtA
metA
rhtС
H+
thrE
+
tdcС
H
H
livJ livM
glyA
ATP
NH4
CO2
pyc
QH2
tdh
NH4+
mqo
NADH
ATP
α-A,β-KB
pflB
Form
Ile
maeA
maeB
glyA
grcA
Acetald
QH2
Gly
O2
QH2
Q
Formate
QH2 CO2
poxB
Acet-P
acs
ackA
Acetate
ATP
ATP
Ethanol
Fum
Acet-CoA
NAD+
nuoABCEFGHIJKLMN
pflB
aceE
aceF
Acet-CoA
kbl
H+
ndh
lpd
pta
Cit
H+
H2 O
cyoABCDE
Iso
Glyox
CO2
NADPH
MQH2
Suc
Suc-CoA
O2
CO2
NADH
QH2
Q
NAD+
sthA
NADPH
NADPH NAPD+
H2O
cydAB
NADP+
α-KG
sucA
sucB
lpd
ATP
NADH NAD+ NADH
Lactate
CO2
NADH
ltaE
grcA
Prop-CoA
ATP
Pyr
CO2
Mal
α-KB
ATP
NADH
NADPH
OAA
Acet-CoA
NADH
livH
ptsI
pykA
pykF
ATP CO2
eda
+
tdcE
P-
PEP
ATP CO2
ppc
Thr
ilvBN
ilvIH
ilvGM
Tyr
Trp
Phe
2-P-G
AMP
+
thrC
livF
aroF
aroH
aroG
murA
NAD(P)H
Hms-P
tdcB
ptsH
ddG-6-P
+
pckA
Na+
P-
edd
NADH
ATP
3-P-G
Cell wall
NH4
ilvA
sstT
crr
rpiB
aspA
NADPH
Hms
H+
rpiA rpe
eda
1,3-P-G
Gly
Ser
MTHF THF
metL
H+
gapA
NADPH
Asp-sa
thrB
yedA
GAP
gapB
tyrB
aspD
thrA
Met
tktB
DHAP
lysC
dapA
Rb-5-P
Xl-5-P
S-7-P
E-4-P
tktA talA talB
ATP
P-
CO2
NADPH
Rl-5-P
gnd
F-1,6-P
ATP
metL
6-P-G
pgl
NADPH
F-6-P
pfkA
pfkB
fbp
NAD+
6-P-GL
zwf
pgi
Asp
thrA
glk
ATP
G-1-P
P
H+
ndh
qor
NADH
ATP
ppnK
NADH
NADH
NAD+
pntA
H+
NADP
NADPH
+
pntB
NADPH
Cytosol
Periplasm
Medium

22.

Р и б о ф л а в и н ( витамин В2 )
Общая характеристика и рынок
1. Мировое производство В2 составляет
около 5000 тонн.
2. Цена 1 кг продукта (в кристаллической форме)
составляет 37 - 40 $.
3. В РФ производства нет. Годовая потребность составляет
приблизительно 300 тонн / год.
ГосНИИгенетика обладает
высокопродуктивными штаммами
бактерий мирового уровня.
Институт в 2007 году вывел эту
технологию на мировой рынок.
К настоящему моменту готова ещё
более эффективная технология

23.

Модель рибосвитч - механизма регуляции экспрессии
генов на уровне транскрипции ( а ) и трансляции ( b )
(а)
регуляция экспрессии
генов на уровне
транскрипции
(b)
регуляция экспрессии
генов на уровне
трансляции

24.

Биокаталитическое получение
акриловых мономеров
Энзиматическая конверсия
нитрилов и амидов
Акриловые мономеры
Акриламид
Акриловая кислота
N-замещённые акриламиды
Полиакриламид
Флокулянты

25.

Российское предприятие по производству
флокулянтов на основе биоакриламида,
г. Пермь

26.

Биотрансформация акрилонитрила в акриламид
с помощью БК-М33
БК
рН 7.6 200С
60
Концентрация
акриламида, %
AN
50
40
M8(0.6 г/л)
30
M33(0.4г/л)
20
10
0
0
5
10
Время
трансформации, час
50 % раствор АА
Продуктивность БК >1000 г АА / г БК
Стоимость БК – около 5 % от стоимости АА
Патент US 5827699
“Strain of Rhodococcus rhodochrous
as a producer of nitrile hydratase”

27.

Цели селекции микроорганизмов
1.
Повышение выхода (г/г) и скорости (г/л/час) биосинтеза;
2.
Снижение биосинтеза побочных продуктов;
3.
Улучшение технологических параметров (скорость, устойчивость к стрессам,
морфология колоний для актиномицетов и нитчатых);
4.
Улучшение питательных потребностей (рост на дешевых субстратах:
глюкозе, ксилозе, арабинозе);
5.
Производство гетерологичных белков для медицины и биокатализа;
6.
Введение новых путей биосинтеза (деградация ксенобиотиков, синтез новых
метаболитов);
Новые цели XXI века :
биоматериалы для нанотехнологий и биоэлектроники (специальные
пептиды; родопсин и т.д.);
конструктивные материалы для медицины и техники (белки паутины,
коллаген);
микрогранулы для топливных элементов и т. д.