Молекулярно-генетические методы исследования, используемые в пульмонологии, интерпретация результатов

1. АО «Медицинский Университет Астана» Кафедра: внутренних болезней интернатуры СРС «Молекулярно-генетические методы исследования,

используемые в пульмонологии, интерпретация
результатов»
Выполнила: Цепелева Т.
Группа: 785 ВБ
Проверила: Имангазинова С.С.
Астана 2017г.

2. Содержание

Введение
1. ПЦР
2. Показания
3. Забор материала
4. Хранение и транспортировка образцов
5. Интерпретация результатов
Список литературы

3.

Введение
Молекулярно-генетические методы предназначаются для
выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК
(аллеля, гена, региона хромосомы). В основе этих методов
лежат манипуляции с ДНК и РНК. Это сложные методы
диагностики, требуют определённых лабораторных условий и
подготовки квалифицированного персонала.

4.

Основные методы:
классический цитогенетический анализ (кариотипирование);
флуоресцентная in situ гибридизация (FISH);
хромогенная in situ гибридизация (CISH);
метод полимеразной цепной реакции (ПЦР);
Саузерн-блоттинг;
анализ первичной последовательности ДНК (секвенирование);
микрочипирование

5.

1.ПЦР
В пульмонологии нашел применение метод ПЦР. Принцип
метода полимеразной цепной реакции был разработан Кэри
Мюллисом (фирма "Cetus", США) в 1983 г. За разработку ПЦРанализа К.Мюллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в
области химии.
Сущность ПЦР заключается в специальной обработке образца
крови, в результате чего в ней увеличивается концентрация ДНК
молекул, определение типа которых в дальнейшем позволяет
установить вид возбудителя и поставить диагноз.

6.

При выполнении исследования ПЦР раз за разом в реакторе
(амплификаторе) повторяются определенные циклы:
1. Первый шаг – денатурация. Слюну, кровь, биоптат, мокроту, в
которых подозревается присутствие ДНК (или РНК) патогена,
помещают в амплификатор, где происходит нагревание
материала и расщепление ДНК на две отдельные цепочки.
2. Второй шаг – отжиг или небольшое охлаждение материала и
добавление к нему праймеров, способных распознавать нужные
участки в молекуле ДНК и связываться с ними.
3. Третий шаг – элонгация – происходит после присоединения 2
праймеров к каждой из цепочек ДНК. В ходе процесса фрагмент
ДНК патогена достраивается, и формируется его копия.

7.

Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных
заболеваний
Прямое определение наличия возбудителей
Высокая специфичность
Высокая чувствительность
Универсальность процедуры выявления различных возбудителей
Высокая скорость получения результата анализа
Возможность диагностики не только острых, но и латентных
инфекций
Ограничения метода ПЦР
Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма
Возможность перекрестной реакции
Изменчивость микроорганизмов

8. 2. Показания

Показания к
проведению ПЦРисследования
Материал для
исследования
Возбудитель
Пневмония
новорожденных,
рецидивирующие
хронические
заболевания
верхних отделов
дыхательной
системы
Эпителиальный
соскоб с задней
стенки глотки,
бронхоальвеолярный
лаваж, мокрота
Сhlamydia
trachomatis,
Сhlamydia
pneumoniae,
Mycoplasma
pneumoniae,
Mycoplasma
hominis,
Mycobacterium
tuberculosis
Туберкулез легких
Мокрота,
бронхоальвеолярный
лаваж
Mycobacterium
tuberculosis,
Mycobacterium
bovis

9. 3. Забор материала

Мокрота. Мокрота используется для диагностики туберкулеза и
реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и
микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в
стерильный (одноразовый) флакон.
Биологические жидкости. Плевральная, бронхоальвеолярный
лаваж забираются по показаниям стандартным способом с
использованием стерильного (одноразового) инструментария в
количестве 0,1- 1,0 мл в стерильные разовые пробирки с плотно
закрывающимися крышками.

10.

Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек – при пневмонии
новорожденных, рецидивирующих хронических заболеваниях верхних
отделов дыхательной системы - забор материала лучше всего
осуществлять с помощью специальных одноразовых стерильных
зондов, имеющих вид ершика и обеспечивающих получение большого
количества клеточного материала с исследуемого участка. Способ слегка вращая ершик, проводят им 1-2 раза по слизистой в местах
предполагаемой локализации инфекционного агента. После забора
материала зонд опускают в пластиковую пробирку, содержащую 100
мкл стерильного физиологического раствора, тщательно
перемешивают, остатки жидкости на зонде отжимают о стенки
пробирки, зонд извлекают (выбрасывают в контейнер с
дезинфицирующим раствором), а приготовленную таким образом
пробу передают в лабораторию.

11. 4. Хранение и транспортировка образцов

Образцы могут находиться при комнатной температуре не более
2-х часов. При необходимости более длительного хранения
пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 28о С на срок не более суток. Более продолжительное хранение
(до 2-х недель) допустимо в замороженном виде в морозильной
камере при температуре минус 20о С. Не допускается повторное
замораживание-оттаивание проб.

12. 5. Интерпретация результатов

Качественный анализ
Отрицательный результат означает, что в веществе, сданном на
исследование, следов возбудителей инфекции не обнаружено.
Положительный результат означает выявление патогенных
вирусов или бактерий в биологическом образце с очень высокой
степенью точности на момент сдачи материала. Если результат
положительный, но признаков активизации инфекции не выявлено –
такое состояние организма называют бессимптомным «здоровым
носительством».
Количественный анализ
Количественный результат определяет специалист конкретно для
определенного вида инфекции. На его основании можно оценить
степень развития, стадию болезни, что дает возможность оперативно
назначить правильное лечение.

13. Список литературы

1. http://medlink.ucoz.ru/
2.http://kpfu.ru/portal/docs/F435865670/Lekciya.2..Molekulyarno_ge
neticheskie.metody..pdf
3. http://biofile.ru/chel/1796.html
4. http://ilive.com.ua/health/molekulyarno-geneticheskie-metodydiagnostika-nasledstvennyh-zabolevaniy_84991i15970.html
5. https://ovzk.blog/2017/03/31/полимеразная-цепная-реакция-пцр/