Транскрипция ДНК и РНК

1.

Транскрипция
ДНК
РНК

2.

ГЕН
Законы Менделя
0
0
I
Х
© Mendel Museum of Genetics
www.mendelmuseum.muni.cz
Грегор Иоганн Мендель
(Gregor Johann Mendel)
1822-1884
1. Закон единообразия гибридов первого поколения
У потомков первого поколения от скрещивания родителей, имеющих
два варианта одного признака (н-р, цвет цветков), будет
присутствовать только один вариант (доминантный) этого признака.
Непроявившийся вариант – рецессивный.
I
I
II
II
II
II
Х
2. Закон расщепления признаков
Во втором поколении (полученном с помощью скрещивания потомков
первого поколения) появляются оба варианта признака в
соотношении доминантный:рецессивный = 3:1.
www.agroatlas.ru

3.

ГЕН
Законы Менделя
0
0
I
Х
I
I
Х
II
II
II
II
II
II
II
II
3. Закон независимого наследования признаков
Варианты одного признака проявляются в потомстве независимо от
вариантов другого признака, и их проявление подчиняется 1-му и 2-му закону.
Mendel, Gregor. Versuche über Plflanzenhybriden.
Verhandlungen des naturforschenden Vereines in Brünn, Bd. IV für das Jahr 1865, Abhandlungen, 3-47.
Дискретный наследственный фактор

4.

ГЕН
Эксперимент Гриффита (1928)
Streptococcus pneumoniae
Тип S
Тип R
Infection and Immunity.-2006.-V.74.-No.8.:4486-4495
profiles.nlm.nih.gov
Фредерик Гриффит
(Frederick Griffith)
1879-1941
Трансформация
бактерий

5.

ГЕН
Эксперимент Херши-Чейз (1952)
ДНК
Хвостовые
фибриллы
Белковая
капсула
(головка)
Стержень
Чехол
Memorial University of Newfoundland
www.mun.ca
Марта Чейз
(Martha Cowles Chase)
1927-2003
Базальная
пластинка
Бактериофаги атакуют E.coli
© Science Photo Library
www.sciencephoto.com
Центрифугирование
Мечение 35S
(метится белок)
Инфицирование
Мечение 32P
(метится ДНК)
Альфред Херши
(Alfred Day Hershey)
1908-1997
Метка
в осадке
(в бактериях)
Метка
в супернатанте
(в вирусах)

6.

ГЕН
Единица наследственности (и мутагенеза) – ограниченный в
пространстве участок генома (ДНК или РНК), ответственный за
проявление определенной функции (белка или РНК).

7.

Цистрон
Цистрон А
Цистрон Б
Цистрон Б
Цистрон – локус генома (участок ДНК),
ответственный за образование белка (РНК)
Цистрон А
Цистрон Б
Цистрон Б
Транскрипция
Транскрипт А
Транскрипт А
Транскрипт А

8.

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы
Элемент – участок ДНК, влияющий на транскрипцию
+1
Транскрипт
+1
+1
+1
сis-элемент
сis-элемент – участок той же молекулы ДНК, с которой считывается
целевой транскрипт

9.

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы
+1
Транскрипт
+1
+1
+1
trans-элемент
trans-элемент – участок молекулы ДНК, с которой не считывается
целевой транскрипт

10.

cis-элементы, trans-элементы и trans-факторы
Фактор – молекула неДНКовой природы, влияющая на транскрипцию
Транскрипт с trans-элемента
+1
trans-элемент
trans-фактор
+1
Транскрипт

11.

Транскрипция
Промотор
Промотор
+1
5’-нетранскрибируемый
Участок ДНК
Промотор обеспечивает
корректное начало и направление транскрипции
Удаление промотора
приводит к сильному подавлению транскрипции,
началу транскрипции со случайных точек и в любом направлении

12.

Цистрон
Цистрон окружен cis-элементами, необходимыми для его регуляции
Промотор
Терминатор
cis-элементы
Цистрон А
Цистрон Б
Цистрон В
РНК А
РНК Б
РНК В

13.

Генетическая регуляция синтеза ферментов,
информационная РНК и оперон
© The Nobel Foundation
Франсуа Жакоб
(François Jacob)
1920 г.р.
Андре Мишель Львов Жак Люсьен Моно
(André Michel Lwoff) (Jacques Lucien Monod)
1902-1994
1910-1976

14.

Оперон
Цистроны
Промотор
Терминатор
Цистрон А
Цистрон Б Цистрон В Цистрон Г Цистрон Д
Оперон – локус генома (участок ДНК),
ответственный за образование нескольких белков (РНК) одновременно
РНК АБВГД
РНК А
РНК Б
РНК В
РНК Г
РНК Д

15.

Lac-оперон
Основной источник энергии для бактерий
D-Глюкоза
При замене глюкозы на лактозу в бактериях появляются 3 фермента
Лактоза
β-галактозид пермеаза – обеспечивает проникновени лактозы в клетку
β-галактозидаза (гидролаза) – гидролизует О-гликозидную связь
β-галактозид трансацетилаза (трансфераза) – ацетилирует лактозу
+

16.

Lac-оперон
LacZ
Промотор
Оператор (cis-элемент)
LacY
LacA
Терминатор
LacY – кодирует β-галактозид пермеазу
LacZ – кодирует β-галактозидазу
LacA – кодирует β-галактозид трансацетилазу
В среде без лактозы
LacZ
LacY
LacA
LacZ
LacY
LacA
РНК-полимераза
Репрессор
В среде с лактозой (
)
РНК-полимераза
иРНК (мРНК)
Репрессор
β-галактозидаза
β-галактозид пермеаза
β-галактозид трансацетилаза

17.

18.

ТРАНСКРИПЦИЯ
реализация генетической информации

19.

Транскрипция
ДНК-зависимая РНК-полимераза
и
РНК-зависимая ДНК-полимераза
РНК-полимераза (трансфераза)
матрица ДНК
матрица ДНК + РНК
АТФ
УТФ
ГТФ
ЦТФ
4xPPi
ДНК-полимераза (трансфераза)
матрица РНК
матрица РНК + ДНК
дАТФ
дТТФ
дГТФ
дЦТФ
4xPPi

20.

Транскрипция
РНК-полимераза
© The Nobel Foundation
Нобелевская премия 1959 г.
«За открытие механизмов биосинтеза рибонуклеиновой кислоты и
дезоксирибонуклеиновой кислоты»

21.

Транскрипция
РНК-полимераза
Фракция, обогащенная белком
Добавляем фракцию,
обогащенную белком
Добавляем радиоактивно
меченные
рибонуклеотиды
Инкубируем
Экстракт ткани
Удаляем нуклеотиды
В растворе
обнаруживается
радиоактивность
Следовательно, метка включилась в полимер нуклеиновой кислоты

22.

Транскрипция
РНК-полимераза
Обрабатываем
РНКазой
Добавляем фракцию,
обогащенную белком
Удаляем
нуклеотиды
Радиоактивность в
растворе
не обнаруживается
Добавляем
радиоактивно
меченные
рибонуклеотиды
Инкубируем
Обрабатываем
ДНКазой
Удаляем
нуклеотиды
В растворе
обнаруживается
радиоактивность
Следовательно, полученная молекула – полимерная РНК

23.

Транскрипция
РНК-полимераза
Обрабатываем Добавляем фракцию,
РНКазой
обогащенную белком
Добавляем
радиоактивно
меченные
рибонуклеотиды
Удаляем
нуклеотиды
Инкубируем
Обрабатываем
ДНКазой
В растворе
обнаруживается
радиоактивность
Радиоактивность в
растворе
не обнаруживается
Следовательно, для синтеза РНК нужна полимерная ДНК
(а полимерная РНК не нужна)

24.

Транскрипция
РНК-полимераза
РНК-полимераза
ДНК-матрица
(NМФ)n + NТФ
(NМФ)n+1 + PPi
ДНК-матрица
Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф
А Г Т Ц Ц Т Г А Г Г Т А Ц А Т Т Ц Г Т А А Ц
У
Ф
У
ФФФ
А
ФФФ
Г
Ц
ФФФ
ФФФ
РНК

25.

Транскрипция
РНК-полимераза
1. РНК-полимераза требует наличия матрицы (ДНК).
2. РНК-полимераза присоединяет рибонуклеозидмонофосфат в
соответствии с правилом комплементарности относительно
нуклеотида матрицы.
3. РНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК.
4. РНК-полимераза не требует наличия праймера.
5. РНК-полимераза присоединяет рибонуклеозидмонофосфат к 3’-ОН
группе рибозы.
6. РНК-полимераза – белок с четвертичной структурой.
7. РНК-полимераза работает только на определенных участках ДНК.

26.

Транскрипция
РНК-полимераза
РНК-полимераза работает только на одноцепочечной ДНК
3’
5’
5’
3’
Для работы РНК-полимеразы требуется
локальное плавление двухцепочечной ДНК
(образование транскрипционного пузыря)
5’
3’
3’
5’

27.

Небольшое отступление
Смысловая и антисмысловая цепи ДНК
Генетический текст записан только в одной из двух цепей - смысловой
5’-АГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦ-3’
3’-ТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГ-5’
Цепь, комплементарная (и антипараллельная) смысловой, - антисмысловая
Генетический текст может быть записан в любой цепи ДНК,
тогда смысловые и антисмысловые участки ДНК чередуются
Смысловая цепь ДНК (ген А)
Антимысловая цепь ДНК (ген Б)
5’-АГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦ-3’
3’-ТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГ-5’
Смысловая цепь ДНК (ген Б)
Антисмысловая цепь ДНК (ген А)
Бессмысленный
участок

28.

Небольшое отступление
Смысловая и антисмысловая цепи ДНК
Генетический текст для разных генов может перекрываться
Смысловая цепь ДНК (ген В)
Смысловая цепь ДНК (ген А)
Антимысловая цепь ДНК (ген Б)
5’-АГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦ-3’
3’-ТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГТЦАГ-5’
Антисмысловая цепь ДНК (ген А)
Смысловая цепь ДНК (ген Б)
Антисмысловая цепь ДНК (ген В)
ген а
ген в
ген б

29.

Транскрипция
РНК-полимераза
РНК-полимераза присоединяет рибонуклеотидмонофосфат
к 3’-ОН группе рибозы
Цепь РНК растет в направлении 5’-3’
Матрицей служит цепь
ДНК в направлении 3’-5’, т.е. АНТИСМЫСЛОВАЯ ЦЕПЬ ДНК
Смысловая цепь ДНК
5’
3’
3’
Антимысловая цепь ДНК
5’
РНК (транскрипт)
3’
5’

30.

Транскрипция
РНК-полимераза
РНК-полимераза – белок с четвертичной структурой
ω
β’
2 α, β, β’ – основной фермент
αI
αII
σ
ω – необходима для сборки фермента
β
σ – необходима для начала транскрипции
Бактериальная РНК-полимераза
состоит из 6 субъединиц – 2 α, β, β’, σ и ω
молекулярный вес ~480 кДа
(1 Да = 1 а.е.м = 1/12 атома 12С)

31.

Транскрипция
РНК-полимеразы
Эукариоты
Ядерные РНК-полимеразы
РНК-полимераза бактерий
РНК-полимераза I
РНК-полимераза архей
РНК-полимераза II
РНК-полимераза вирусов
(У бактериофагов - 1 субъединица,
нет четвертичной структуры)
РНК-полимераза III
РНК-полимераза IVa
РНК-полимераза IVb
Неядерные РНК-полимеразы
РНК-полимераза митохондрий
РНК-полимераза хлоропластов

32.

Транскрипция
РНК-полимераза
РНК-полимераза работает только на определенных участках ДНК
Точка начала транскрипции
ДНК
5’-нетранскрибируемый
участок ДНК
Точка окончания транскрипции
+1
Транскрибируемый
участок ДНК
Транскрипт (РНК)
3’-нетранскрибируемый
участок ДНК

33.

34.

Транскрипция
Этапы транскрипции
1. Инициация
2. Элонгация РНК
3. Терминация

35.

Транскрипция
Инициация транскрипции у бактерий
Промоторные cis-элементы бактерий
Бокс Прибноу-Шаллера, 1975 (элемент -10)
РНК-пол
Обработка ДНКазой
РНК-пол
Очистка ДНК
-10 п.н.
+1
Вероятность Т
присутствия Г
нуклеотида Ц
А
Консенсус = ТАТААТ

36.

Транскрипция
Инициация транскрипции у бактерий
Промоторные cis-элементы бактерий
Бокс Гилберта, 1976 (элемент -35)
-35 п.н.
-10 п.н.
+1
Т
Г
Ц
А
Консенсус = ТАГАЦА
Вероятность
присутствия
нуклеотида

37.

Транскрипция
Инициация транскрипции у бактерий
1. РНК-полимераза связывается с ДНК
ω
β’
αI
αII
σ
β
2. РНК-полимераза «ищет» промотор
Элементы -35 и -10
определяют правильность
посадки РНК полимеразы,
т.е. точку начала и
направление транскрипции
3. РНК-полимераза находит промотор, образуется
закрытый транскрипционный комплекс

38.

Транскрипция
Инициация транскрипции у бактерий
4. РНК-полимераза плавит ДНК между элементом -10
и точкой начала транскрипции, образуется
открытый транскрипционный комплекс
5. РНК-полимераза включает первый нуклеотид
6. РНК-полимераза включает несколько первых нуклеотидов

39.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
Ядерные РНК-полимеразы
РНК-полимераза I
РНК-полимераза II
РНК-полимераза III
Рибосомная РНК
45S рРНК
мРНК
тРНК
5S рРНК
28S рРНК
18S рРНК
5.8S рРНК
Гены I класса
Гены II класса
Гены III класса

40.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
РНК-полимераза II
С-концевой домен
РНК-полимеразы II (CTD)
от 25 до 52 повторов
последовательности
Тир-Сер-Про-Тре-Сер-Про-Сер
тирозин
серин
треонин
6
8
1
11
3
4
10
7
5
9
2
12
РНК-полимераза II
состоит из 12 субъединиц
молекулярный вес ~550 кДа

41.

Ковалентные модификации белков
Фосфорилирование
Протеинкиназа
(трансфераза)
CH2
OH
CH
OH
O
CH3
-
O
P
CH2
O-
CH2
CH2
CH
O-
CH3
O
P
O
O-
O
OH
O
-
O
P
O
O-

42.

Ковалентные модификации белков
Ацетилирование
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH3+
Ацетилаза
(трансфераза)
CH2
CH2
HN
C
O
CH3

43.

Ковалентные модификации белков
Ацетилирование
-
+
-

44.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
Общие факторы инициации транскрипции РНК-полимеразы II
Для инициации транскрипции РНК-полимеразе
требуются вспомогательные факторы
Базальные факторы транскрицпии
Гомология
с σ-субъединицей
бактериальной
РНК-полимеразы
TFIIA – 3 субъединицы
TFIIB – 1 полипептид
TFIID – до 17 субъединиц
TFIIE – 4 субъединицы
TFIIF – 2 субъединицы
TFIIH – 10 субъединиц

45.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
Промоторы генов II класса
ТАТА-бокс (бокс Голдберга-Хогнеса, 1978)
Инициатор (Inr)
+1
~ -31 – -26
Т
Г
ТАТА АА
А А
-2
+4
Т
YYAN YY
А
Y - пиримидин (Т или Ц)
N - любой нуклеотид

46.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
Связывание базальных факторов транскрипции с промотором
Шаг 1. TFIID (TBP) связывается с ТАТА-боксом
TFIID = TBP + белки TAF
TAF
TBP-Associated Factor
TBP
TATA-box Binding Protein
TAF1 (TAFII250)
TAF2 (TAFII150)
TAF3 (TAFII140)
TAF4 (TAFII130/135)
TAF4B (TAFII105)
TAF5 (TAFII100)
TAF6 (TAFII70/80)
TAF7 (TAFII55)
TAF8 (TAFII43)
TAF9 (TAFII31/32)
TAF9B (TAFII31L)
TAF10 (TAFII30)
TAF11 (TAFII28)
TAF12 (TAFII20/15)
TAF13 (TAFII18)
TAF15 (TAFII68)
TBP связывается
с малой
бороздкой ДНК
ТАТА-бокса
и изгибает ДНК

47.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
Связывание базальных факторов транскрипции с промотором
Шаг 2. TFIIA и TFIIB связываются с TFIID
(образуется комплекс DAB)
Это связывание определяет
точку начала и направление транскрипции
TFIIA
TFIID
TATA
TFIIB
+1
Inr

48.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
Связывание базальных факторов транскрипции и РНК-полимеразы
с промотором
Шаг 3. С DAB связывается РНК-полимераза II в комплексе с TFIIF, TFIIE и TFIIH
6
8
1
4
11
3
7
10
12
TFIIH
5
TFIIA
TFIIB
TATA
9
TFIIF
TFIID
2
TFIIE
TFIIF обеспечивает взаимодействие с TFIIB
CTD РНК-полимеразы II связывается с DAB
Образуется закрытый транскрипционный комплекс
TFIIA
TFIID
TFIIB
TATA
+1
TFIIF Inr
TFIIH
TFIIE
+1
Inr

49.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
Начало транскрипции
Шаг 4(а). TFIIH плавит ДНК, TFIIE стабилизирует транскрипционный пузырь
Образуется открытый транскрипционный комплекс
Шаг 4(б). РНК-полимераза включает первый нуклеотид
Шаг 4(в). TFIIH фосфорилирует CTD РНК-полимеразы II,
РНК-полимераза утрачивает связь с DAB и начинает синтезировать РНК
TFIIA
+1
TFIID
TFIIB
TATA
Ф Ф
Ф Ф
TFIIF
TFIIH
TFIIE

50.

Транскрипция
Инициация транскрипции у эукариот
Начало транскрипции
Шаг 5. РНК-полимераза включает несколько нуклеотидов в цепь РНК
и останавливается
TFIIA
TFIID
TFIIB
Inr
TATA
Ф Ф
+1
Ф Ф
TFIIE
TFIIF
TFIIH

51.

52.

Транскрипция
Элонгация транскрипции у бактерий
6. РНК-полимераза включает несколько первых нуклеотидов
7. РНК удаляется,
РНК-полимераза возвращается в точку начала транскрипции
7. Субъединица σ диссоциирует,
РНК-полимераза продолжает синтезировать РНК

53.

Транскрипция
Элонгация транскрипции у бактерий
«Собачка» храпового
механизма
«Мостик» храпового
механизма
αI αII
Смысловая цепь ДНК
β
ДНК
ДНК-связывающий
сайт
β’
Антисмысловая цепь ДНК
РНК
РНК-связывающий
сайт

54.

Транскрипция
Работа храпового механизма
«Мостик»
Антисмысловая
нить
ДНК
РНК
Смысловая нить
«Собачка»
Новый
нуклеотид

55.

Транскрипция
Элонгация транскрипции у эукариот
Шаг 5. РНК-полимераза включает несколько нуклеотидов в цепь РНК
и останавливается
TFIIA
TFIID
TFIIB
+1
Inr
TATA
Ф Ф
Ф Ф
Шаг 6. С РНК-полимеразой связываются факторы элонгации (TFIIS и другие),
которые снижают вероятность остановок РНК-полимеразы
TFIIS
TFIIA
TFIID
TATA
TFIIB
+1
Inr
Ф Ф
Ф Ф

56.

Транскрипция
Терминация транскрипции у бактерий
Терминация без вспомогательных белков
Терминирующий элемент
3’-NNNNNNNТАЦГГЦГТNNNNАЦГЦЦГТАААААААААNNNNNNN-5’
5’-NNNNNNNАТГЦЦГЦАNNNNТГЦГГЦАТТТТТТТТТNNNNNNN-3’
N – любой нуклеотид
Палиндром
5’-NNNNNNNАУГЦЦГЦАNNNNУГЦГГЦАУУУУУУУУУ -3’
Образование шпильки замедляет транскрипцию
Длинный тракт УУУУУУУУ образует слабую связь с матрицей AAAAAAAA.
Это приводит к диссоциации комплекса РНК-полимеразы и транскрипта с матрицы ДНК

57.

Транскрипция
Терминация транскрипции у бактерий
Терминация с участием вспомогательных белков
Закодированный в ДНК Rho-связывающий сайт
Rho-связывающий сайт
транскрибируется
Белок Rho связывается
со своим сайтом
Белок Rho «догоняет»
РНК-полимеразу
Белок Rho выталкивает молекулу РНК
из транскрипционного пузыря,
комплекс диссоциирует

58.

Транскрипция
Терминация транскрипции у эукариот
Сигнал полиаденилирования
Зона терминации транскрипции (терминатор)
500-2000 н.
Поли-А хвост

59.

60.

Транскрипция
ДНК
+1
Транскрипт (РНК)

61.

Транскрибируемая и кодирующая ДНК
Нетранскрибируемая ДНК
Транскрибируемая ДНК
Нетранскрибируемая ДНК
Кодирующая ДНК
Промотор
Терминатор
Нетранслируемая
РНК
Транслируемая
РНК
Транскрипт
Трансляция
Белок
Нетранслируемая
РНК

62.

Экзон-интронная структура цистронов эукариот
Цистрон прокариот
Транскрибируемая ДНК
Кодирующая ДНК
Некодирующая ДНК
Цистрон эукариот
Транскрибируемая ДНК
Кодирующая ДНК
(совокупность экзонов)
Экзон 1
Интрон 1
Экзон 2
Интрон 2
Экзон 3
Некодирующая ДНК
Интрон 3
Экзон 4

63.

Экзон-интронная структура цистронов эукариот
Экзон 1
Интрон 1
Экзон 2
Интрон 2
Экзон 3
Интрон 3
Экзон 4
Транскрипция
Транскрипт = Незрелая РНК
Экзон 1
Интрон 1
Экзон 2
Интрон 2
Экзон 3
Интрон 3
Созревание
Экзон 1
Экзон 2
Экзон 3
Экзон 4
Экзон 4

64.

65.

ПРОЦЕССИНГ мРНК

66.

Процессинг мРНК
Этапы процессинга
1. Кэпирование
2. Полиаденилирование
3. Сплайсинг

67.

Процессинг мРНК
Кэпирование
NH2
N
O
5’
-
O
P
O
O
-
O
P
-
O
N
O
O
O
P
N
N
N
O
-
O
H
O
H
H
O
H
OH
P
O
NH
N
NH2
N
NH2
O
O
OH
H
H
O
H
OH
N
O
N
O
Незрелая мРНК
P
O
O
O
OH
O
NH
H
H
O
H
OH
P
N
O
O
OH
O
H
H
O
H
OH
O-
P
-
O
3’
O

68.

Процессинг мРНК - кэприрование
1. Гидролиз одной 5’-концевой фосфатной группы
NH2
N
O
O
-
O
P
O-
O-
-
O
P
-
O
N
O
O
O
P
N
N
N
O
-
O
H
O
H
H
O
H
OH
P
O
NH
N
NH2
N
NH2
O
O
OH
H
H
O
H
OH
N
O
N
O
P
O
O
O
OH
O
NH
H
H
O
H
OH
P
O
N
O
OH
O
H
H
O
H
OH
P
O-
O-
O

69.

Процессинг мРНК - кэприрование
2. Присоединение ГТФ (минус пирофосфат)
O
N
N
HN
H2 N
NH2
N
N
O
O
O
H
H
H
OH
H
OH
P
O
O
O-
P
O-
N
O
O
P
O
O
H
O
H
OH
P
P
-
O
P
-
O
NH2
N
O
H
O
N
O
O
O
NH
NH2
O
O
O
N
H
-
-
N
O
OH
O
N
H
H
O
H
OH
N
O
N
-
O
P
O
O
O
OH
O
NH
H
H
O
H
OH
P
O
N
O
-
O
H
O
H
H
O
H
OH
P
O-
O-
O

70.

Процессинг мРНК - кэприрование
3. Метилирование по 7 атому гуанина
O
N+
HN
H2 N
NH2
CH3
N
N
N
O
O
O
H
H
H
OH
H
OH
P
O-
O
O
P
O-
N
O
O
P
O
H
H
O
H
OH
P
O
N
H
NH
N
NH2
N
NH2
O
O
-
Кэп
N
O
O-
O
(m7G)
N
O
H
H
H
O
H
OH
N
O
N
O
P
O
O
O
OH
O
NH
H
H
O
H
OH
P
O
N
O
-
O
H
O
H
H
O
H
OH
P
O-
O-
O

71.

Процессинг мРНК - кэприрование
4. Метилирование нескольких нуклеотидов по 2’ атому рибозы
O
N+
HN
H2 N
NH2
CH3
N
N
N
O
O
O
H
H
H
OH
H
OH
P
O
O
-
O
P
-
O
N
O
O
O
P
N
N
O
N
O
-
O
H
H
H
O
O
H
NH
N
NH2
N
CH3
O
Кэп
(m7G)
P
O
NH2
O
H
OH
H
O
N
O
H
O
N
CH3
O
P
O
O
O
-
O
H
O
NH
H
H
O
H
OH
P
O
N
O
-
O
H
O
H
H
O
H
OH
P
O-
O-
O

72.

Процессинг мРНК - кэприрование
Кэпирование происходит непосредственно в процессе транскрипции
РНК-полимеразой II
TFIIA
TFIID
TFIIB
+1
Inr
TATA
CEC
Ф Ф
Ф Ф
Capping
Enzyme
Complex
CEC
(Комплекс ферментов кэпирования)
TFIIA
TFIID
TFIIB
+1
Inr
TATA
Ф Ф
Ф Ф
CEC
Кэп

73.

Процессинг мРНК - кэприрование
Функции кэпа
Транспорт из ядра в цитоплазму
мРНК кэпируется
С кэпом связывается
транспортирующий белок
Защита от 5’-экзонуклеаз
Некэпированная мРНК быстро гидролизуется
Кэпированная мРНК устойчива к нуклеазам
Транспортирующий белок
переносит мРНК в цитоплазму

74.

Транскрипция
Терминация транскрипции у эукариот
Сигнал полиаденилирования
Зона терминации транскрипции (терминатор)
500-2000 н.
Поли-А хвост

75.

Процессинг мРНК
Полиаденилирование
Сигнал полиаденилирования
ААУААА
Сайт
разрезания
ГУ-регион

76.

Процессинг мРНК - полиаденилирование
Нуклеаза разрезает РНК у сайта полиаденилирования
РНК-полимераза II
ААУААА
ГУ-регион
CPSF
CstF
Сайт
разрезания
CPSF – эндонуклеаза
CstF – фактор узнавания
ААУААА
ГУ-регион
CPSF
Эндонуклеаза разрезает РНК
CstF

77.

Процессинг мРНК - полиаденилирование
Полиаденилатполимераза строит поли-А-хвост
РНК-(А)n
ААУААА
PAP
АТФ
РНК-(А)n+1
PPi
(безматричный синтез РНК)
CPSF
PAP
PAP – полиаденилатполимераза
ААУААА
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
~ 250xA
PAP

78.

Процессинг мРНК - полиаденилирование
Роль поли-А-хвоста
Защита от 3’-экзонуклеаз – стабилизация РНК
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Белок
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Белок
AAAAAAAAAAAAAAAAAA
Белок

79.

Процессинг мРНК
Сплайсинг
Экзон 1
Интрон 1
Экзон 2
Интрон 2
Экзон 3
Интрон 3
Экзон 4
Вырезание интронов
Экзон 1
Экзон 2
Экзон 3
Экзон 4
Структура интрона
Точка ветвления
Экзон 1
ГУ
5’-сайт интрона
А
Экзон 2
АГ
3’-сайт интрона

80.

Процессинг мРНК - сплайсинг
Переэтерификация точки ветвления и 5’-сайта интрона
O
R2
O
P
O
OH
+
R1
OH
R1
OH
O
P
OH
+
R2
OH
OH
Экзон 1
Экзон 2
ГУ
А
АГ
2’-OH группа рибозы
Экзон 2
А
Экзон 1
2’
«Лассо»
OH
УГ
АГ
О
-О
P
5’
О
О

81.

ГУ
ГУ
O
O
O
O
P
O
O
O-
H
H
O
H
OH
H
O
P
O
O
O-
H
H
OH
H
OH
H
N
O
P
NH
O
N
O
N
NH2
O
N
NH
O
O-
H
O
H
OH
H
O
NH
H
P
N
O
O
O
H
O
H
OH
P
P
O
O
H
O
H
OH
P
H
H
O
H
OH
H
N
O
O
O
O
O-
NH2
O
NH
H
O-
O
N
O
-
H
H
H
O
O
O
O-
N
O-
H
H
O
H
OH
H
O
P
O
O
O-
H
H
O
H
OH
H

82.

ГУ
А
2’-OH группа рибозы
O
N
N
OO
P
O
NH
N
O
O
NH2
O
P
O
O
NH2
O
O
-
H
O
H
OH
H
O
P
O
N
H
H
O
H
OH
H
NH
H
N
O
-
P
O
O
H
O
H
OH
H
O
P
H
H
O
H
OH
H
H
O
P
O
O
O-
O
O
-
O
H
H
O
H
OH
H
H
H
O
H
OH
H
N
O
O
-
N
O
O-
O
N

83.

А
2’
«Лассо»
УГ
О
-О
P
5’
О
О
O
O
NH2
P
O
N
O
O-
H
H
O
H
OH
H
O
P
N
O
O
H
H
O
O
P
H
O
O
P
P
O
O
P
O
O
H
H
H
OH
H
H
N
N
N
H
H
N
O
NH
O
HO
O
O
HO
H
H
O
H
O
H
H
H
H
HO
H
-
O
O
O
O
O-
O
OH
O
O
N
O
-
H
-
N
O
H2N
O
NH

84.

Процессинг мРНК - сплайсинг
Вытеснение лассо
Экзон 2
А
АГ
2’
О
УГ
-О
P
5’
О
О
Экзон 1
OH
Экзон 1 Экзон 2
А
АГ
2’
О
УГ
-О
P
5’
О
О

85.

Процессинг мРНК - сплайсинг
Роль интронов и сплайсинга
Защита кодирующей части гена от повреждений
Экзон 1
Интрон 1
Экзон 2
Интрон 2
Экзон 3
Интрон 3
Экзон 4
Кодирование одним геном нескольких белков
Альтернативный сплайсинг
Экзон 1
Экзон 1
Интрон 1
Экзон 2
Интрон 2
Экзон 3
Белок 1
Экзон 2
Экзон 3
e1e2e3
Экзон 1
Экзон 2
e1e2
Белок 2
Экзон 1
Экзон 3
e1e3
Белок 3
Экзон 2
Экзон 3
e2e3
Белок 4

86.

Процессинг мРНК
Зрелая мРНК
Экзон 1
Кэп
Интрон 1
Экзон 2
Интрон 2
Экзоны
Экзон 3
Интрон 3
Экзон 4
Поли-А-хвост
Трансляция

87.

88.

Транскрипция
Методы изучения
Нозерн-блоттинг
Саузерн-блоттинг (1975)
Электрофорез ДНК
Вымачивание в щелочи
для расхождения
цепей ДНК
The Journal of the American Medical Association.-2005.-Vol.294.-No.11.-P.1327-1330
Эдвин Мэллор Саузерн
(Edwin Mellor Southern)
1938 г.р.
Гель,
вид сбоку
Перенос (блотинг)
на фильтр
Фильтр,
вид сбоку

89.

Транскрипция
Методы изучения
Нозерн-блоттинг
Саузерн-блоттинг
Интересующий нас фрагмент ДНК
Фильтр,
вид сбоку
Денатурированная
ДНК на фильтре
+
ДНК-полимераза I
+
Задача:
определить, присутствует
ли среди этих молекул
ДНК участок, который нас
интересует
(например, какой-то ген)
α-[32P]-дАТФ
α-[32P]-дГТФ
α-[32P]-дЦТФ
α-[32P]-дТТФ

90.

Транскрипция
Методы изучения
Нозерн-блоттинг
Саузерн-блоттинг
Радиоактивно меченный
фрагмент ДНК,
интересующий нас
Гибридизация с денатурированными
образцами ДНК на фильтре
Денатурация
Фильтр
Авторадиография
на рентгеновской пленке

91.

Транскрипция
Методы изучения
Нозерн-блоттинг
«Southern» (Саузерн) – «южный»
«Northern» (нозерн) – «северный»
Перенос на фильтр РНК
«Western» (вестерн) – «западный»
Перенос на фильтр белков
(иммуноблотинг)
«Eastern» (истерн) – «восточный»
Перенос на фильтр белков
после изоэлектрофокусирования

92.

Транскрипция
Методы изучения
Нозерн-блоттинг
28S рРНК
18S рРНК
Зона, где находится
большинство мРНК
Блотинг
Гибридизация с фрагментом ДНК,
соответствующим интересующему нас гену
Авторадиография
Количество РНК, транскрибированной
с интересующего нас гена, увеличилось

93.

Транскрипция
Обратная транскриптаза
(ДНК-зависимая РНК-полимераза)
РНК
+ праймер
РНК
+ дезоксинуклеотиды
РНК
ДНК

94.

Транскрипция
Методы изучения
ОТ-ПЦР
Задача: определить наличие в клетках РНК,
транскрибированной с определенного гена
Праймер
Обратная транскриптаза
5’-ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ-3’
(ОТ)
Синтез ДНК
Раствор РНК
ПЦР

95.

Транскрипция
Методы изучения
ОТ-ПЦР
ПЦР с праймерами, соответствующими интересующему нас гену
ДНК
1-й цикл
2-й цикл
…..
Электрофорез
Количество транскриптов
интересующего нас гена
уменьшается