Место проточной цитофлюориметрии в клинической онкогематологии

1.

Место проточной
цитофлюориметрии в
клинической
онкогематологии
место проточной
цитофлюориметрии в
клинической онкогематологии

2.

3.

4.

5.

6.

методы диагностики
морфология
иммунофенотипирование
диагноз
классификация
оценка факторов риска
определение МОБ
цитогенетика
молекулярная
генетика
цитохимия

7. цитометрия сегодня

Проточная цитометрия-измерение
параметров отдельных клеток,
пересекающих одна за другой лазерный луч
FACS- Fluorescence Activated Cell Sorting

8. принцип метода

• иммунологическая реакция антиген/антитело
• особенность: АТ коньюгированы с
флюорохромом

9.

возможности проточной
цитометрии
диагностика онкогематологических заболеваний
оценка минимальной остаточной болезни (МОБ)
оценка качества трансплантата гемопоэтических клеток
определение субпопуляционного состава лимфоцитов
оценка жизнедеятельности микроорганизмов
оценка процессов метаболизма клетки
оценка процессов апоптоза
оценка цитокинового профиля

10.

проточная цитометрия рекомендована
(2006 Bethesda International Consensus)
-панцитопения
-морфологически выявленные атипичные клетки или
бласты
-лейкоцитоз
-плазмацитоз
-лимфоаденопатия
-органомегалия
-наблюдение в динамике за пациентами с уже
установленным гематологическим заболеванием

11. эволюция проточной цитометрии

микроскопия
химические красители
электороника
компьютерная техника.

12.

исторические «вехи»
1590 микроскоп A. Leewenhowk
1742 светорассеяние М.Ломоносов
1880 технология окрашивания P.Erlich
1880Стабильность потока жидкости Rayleigh
1934 фотодетекция клеток и частиц A.Moldavan
1950 оценка размеров микроскопических частиц Coulte
1965 сортер (капельное отклонение) Flwuler
1972 FACS Herzenberg

13.

концепция иммунофлюоресценции
1940-е
Albert Coons

14. получение моноклональных антител 1975

1985
Georges J.F.
Köhler
César Milstein

15.

элементы цитометра
FL4 APC
FL3 PerCP
FL2 PE
FL1 FITC
лазер
488 нм
635 нм
SSC
FSC

16.

"pulse cytophotometry"
(''Impulszytophotometrie'').
flow cytomerty 1988

17.

18.

периферическая кровь

19. Параметры гистограммы

Дубль позитивная
популяция
PE FL
Популяция,
позитивная
по PE
Негативная
популяция
FITC FL
Популяция
позитивная по
FITC

20. параметры гистограммы

3-/4+
3-/4-
3+/4+
3+/Y-

21. Материал для исследования

периферическая кровь
костный мозг
ликвор
любая суспензия клеток

22. доставка и хранение

кровь и КМ : а/коагулянт гепарин, ЭДТА
плевральная, асцитическая жидкости, ликвор
без а/коагулянта
доставка-24 ч

23. Гепарин vs ЭДТА

Гепарин - после выделения клеток на Ficoll можно
использовать 72 часа
ЭДТА- меньше потерь миелоидных клеток ( не «прилипают» к стенкам
пробирки , меньше тромбоцитарных агрегатов), можно
использовать один и тот же материал для гематологического
анализатора и морфологии
параметры светорассеяния ухудшаются быстрее в материале с ЭДТА

24. хранение

комнатная ? (18 to 22 C)
хранение при T<10 0C может приводить к адсорбции
иммуноглобулинов или к селективной потере антигенов
но! Некоторые типы клеток (ЛБ) нестабильны при
высокой температуре

25.

CD-кластер дифференцировки
• антигенная клеточная структура
• Париж 1982
1 международное совещание
« Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA)»
Установлена номенклатура моноклональных
антител
• На сегодняшний день идентифицировано
320 CD

26.

этапы цитофлюориметричекского
исследования
• преаналитический
антител)
(оптимальная
• пробоподготовка
• сбор данных на цитометре
• анализ полученных результатов
комбинация

27.

пробоподготовка
комбинация антител с различными
флюорохромами для выявления
маркеров интереса
лизирующий
раствор
анализируемый
образец

28. выбор коньюгатов

выбор флюорохрома зависит от плотности
антигена на клетке
более яркий флюорохром для редких антигенов
менее яркий- для более частых
Антиген высокой
плотности
Антиген низкой
плотности
CDx
CD45
CD13 CD33 CD19
CDz

29. проблемы

потеря клеток во время «отмывания»
неполный лизис, много «debris»: липидемия,↑ретикулоцитов
( криоглобуленемия), пхт- решение- отмыть клетки или выделить
MNC, использование ДНК красителей -7-AAD , VIO 16
неспецифическое связывание

30.

WHO 2008
EGIL
European Group for
Immunophenotypic
characterization of
Leukemias
РМАПО

31.

Consensual European
Immunophenotyping panels for
Leukemia  
Should be able to recognize
(должны быть способны
распознать)
1.Бифенотипический ОЛ
2. Острый лимфобластный лейкоз
а) В-линейный B-I, B-II, B-III, B-IV
б) Т-линейный Т-I,T-II T-III, T-IV
3. ОМЛ
а) М0
б)гранулоцитарной и моноцитарной дифференцировки
в)ОПЛ
г)эритроидный ОМЛ
д)мегакариоцитарный ОМЛ

32.

Should be able to recognize features compamatible with
(должны быть способны распознать
признаки, сравнимые с:
1.ХЛЛ
2.ВКЛ
3.В-клеточные лимфомы
а) Лимфома Беркитта
б) Фолликулярная Лимфома
в) лимфома из клеток мантийной зоны
г) лимфома из клеток маргинальной зоны
д) и др….
4.Т-клеточные пролиферации
5.БГЛ
6.NK-клеточные пролиферации

33. антигены

Панлекоцитарный : CD45
Линейно неограниченные: СD34, CD 38, CD133, HLA-DR
Линейно ассоциированные:
-миелоидной линии CD13,CD33, CD117,MPO
-лимфоидной линии CD19, CD 7, CD 56
Дифференцировочные антигены- отражают стадии
дифференцировки клеток
Активационные антигены CD25, CD38

34. выявление антигенов

на мембране клетки
в цитоплазме

35.

экспрессия антигенов
-асинхронная – одновременная экспрессия антигенов разной
стадии дифференцировки : CD34+/CD22+
-аберрантная - одновременная экспрессия антигенов разной
линии дифференцировки : CD19+/CD5+
-эктопическая- одновременная экспрессия антигенов разного
«места жительства» : CD1a в КМ

36. Как определить линейность?

MPO + CD33/13 117= миелоидный
cytCD79a/cytCD22+CD19= В-линейный
Cyt СD3+CD7= Т-линейный
НО!!
ОМЛ с t(8;21) часто CD19+
ОМЛ t(15;17) часто CD2+

37. «внутренняя проверка достоверности»

В-линия
Т-линия
CD19=CD20= CD22 (CD23 ,FMC7 реагируют с
субпопуляцией)
моноциты CD33br = CD14br и CD4+/CD3
нейтрофилы CD15 = CDw65br
эритроидные CD45(neg)= CD235
CD2=CD3=CD5=CD7
CD4+ CD8= CD3
CD19/kappa +CD19/lambda= CD19
T+ B+NK = кол-во лимфоцитов CD45+/CD14-

38.

домашнее задание!

39.

40.

41.

42.

дифференцировка В-лимфоцитов
лимф.
стволовая
клетка
Про-В
Пре-В
промежуточная
зрелая В-клетка
В-клетка
плазматическая
В-клетка
HLA-DR
TdT/CD34
cyIgM
sIg
CD19
CD10
CD5
CD79a
cyCD22
CD22
CD20
CD38 CD138

43.

44.

дифференцировка Т-лимфоцитов
Лимфоидная
стволовая
клетка
протимоцит
common
тимоцит
хелперный/
супрессорный
T-лимфоцит
зрелый
тимоцит
активированный
Т-лимфоцит
HLA-DR
TdT
cyCD3
sCD3
CD2, CD7
CD4/8
CD4 или CD8
CD5
CD1a

45.

46.

47. миелоидная дифференцировка

CFU-GM
Mb
Pmy
Myl
Meta
Seg
HLA-DR
CD34
TDT,CD7
CD4
CD33
CD13, CD65
CD15
MPO
Lactoferrin

48. моноцитарная дифференцировка

КОЕ-ГМ
монобласт
промоноцит
моноцит
HLA-DR
CD34
TDT,CD7*
CD4
HLA-DR
CD14
CD13, CD33
CD15
CD64
макрофаг

49.

Периферическая кровь
Костный мозг

50.

51.

Спасибо за внимание!