Внеклеточное молекулярное клонирование (метод полимеразной цепной реакции)

1. Лекция 10. Клонирование генов Часть 2. Внеклеточное молекулярное клонирование (метод полимеразной цепной реакции)

Содержание:
1. Теория и технология метода ПЦР……..………….
2. Прикладное использование метода ПЦР………...

2.

1
Теория и технология
метода ПЦР

3.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод
клонирования последовательности ДНК (гена) в
искусственных условиях (in vitro) на основе
многократно повторяющейся реакции полимеразного
копирования фрагмента ДНК с использованием
фланкирующих праймеров, комплементарных его 3′концам.
Амплификация - многократное копирование
фрагмента ДНК.
Ампликон – продукт амплификации.

4.

ДНК-мишень
1-й
праймер
3′
5′
5′
3′
2-й
праймер

5.

Основные компоненты ПЦР:
ДНК-мишень – фрагмент ДНК, подлежащий
амплификации;
два праймера - синтетических нуклеотида длиной
15 – 30 нуклеотидов, комплементарных 3′- концам
ДНК- мишени (выполняют роль ДНК-затравки и
ДНК- зонда);
ДНК-полимераза;
свободные нуклеотиды.

6.

ПЦР – полициклический процесс каждый цикл
которого включает 3 этапа:
1. Денатурация ДНК путем нагревания реакционной
смеси до 950С;
2. Отжиг праймеров на 3′- концах ДНК-мишени (при
50 – 700С);
3. Элонгация – синтез комплементарных цепей на
матрице ДНК-мишени.
Число циклов ПЦР: 30…50.

7.

1-й цикл
Денатурация
Элонгация
900С
Отжиг
2-й цикл

8.

3-й цикл:
4-й цикл:

9.

30-й цикл:
В ходе ПЦР количество амплифицируемого
фрагмента ДНК-мишени увеличивается
1 073 741 824в
1 молекула
60 молекул
молекулы
прогрессии:
2n
n
~2
n – n – 1 ), или ~ 2n
А
=
М
·
(
2
Конечный результат ПЦР – наработка такого
количества вещества специфического фрагмента
где
А - (мкг),
число копий
ДНК-мишени;
ДНК
которое
можно зафиксировать уже
М – исходное число молекул ДНК-мишени
визуально.
циклов
ПЦРn –– число
мощный
«усилитель» сигнала о каком-либо
биологическом объекте в виде уникальной, присущей
только ему последовательности его генома.

10.

В 1985 г. Карл Мюллис –
запатентовал
изобретенный
им
метод амлификации ДНК путем
полимеразной цепной реакции.
В 1993 г. за изобретение ПЦР
удостоен Нобелевской премии по
химии.
Карл Мюллис
(род. 1944, Северная
Каролина, США)

11.

Технология метода ПЦР
1. Выделение образца ДНК
2. Подготовка реакционной смеси (20…100 мкл)
подбор праймеров
- праймеры должны быть
строго гомологичны
1500 п.н.
амплифицируемому участку ДНК и ограничивать
3′
область генома уникальную по длине 5′и
нуклеотидной последовательности с нулевой
вероятностью повторения в геноме.
5′
??????
3′

12.

ДНК полимераза – применяется термостабильная
ДНК-полимераза из бактерии Thermophilus aquaticus
(Taq-полимераза) – выдерживает температуру 950С.

13.

3. Амплификация – проводится в приборах–
амплификаторах.
Денатурация
900
700
Элонгация
500
Отжиг
1-й цикл
2-й цикл
3-й цикл

14.

4. Оценка результатов ПЦР
- проводится путем разделения продуктов
1
2
3
4
5
амплификации электрофорезом с последующим
сравнением
с контрольным фрагментом заданной
Контрольный
фрагмент
длины.
300
200
100

15.

Трансиллюминатор

16.

ПЦР: биотехнология или нет ?
Сырьё
Молекула
ДНК
Ферментация и
биотрансформация
Реакция
полимеразного
копирования
(репликация
ДНК)
Конечный
продукт
Информация
о биообъекте

17.

2
Прикладное использование
метода ПЦР

18.

ПЦР – современный диагностический инструмент,
позволяющий
идентифицировать
биологические
объекты
по
ничтожно
малым
количествам
биоматериала.
ДНК-диагностика (гено-диагностика) – методы
получения информации о биологических объектах на
основании выявления особенностей их генома.
Основные направления :
1. диагностика инфекционных болезней
2. диагностика наследственных болезней
3. ДНК-идентификация личности
4. ДНК-диагностика качества продуктов питания

19.

Диагностика инфекционных болезней
?
Образцы ДНК
Праймеры
К
1
2
Праймеры
К
1
2
Праймеры
К
1
2

20.

Иммунологический метод диагностики
Разведение
сыворотки
1:256
1:2
антиген

21.

22.

Преимущества ПЦР-диагностики:
• специфичность
• высокая чувствительность – раннее обнаружение
инфекции

23. ДНК-идентификация

молекулярно-генетические маркеры половой
принадлежности
Амелогенин – белок,
образующий структурный
матрикс зубной эмали
У человека ген амелогенина (AMG) – белка,
образующего структурный матрикс зубной эмали,
локализован в половых хромосомах Х и Y.

24. Различия в аллелях гена амелогенина человека

Делеция 6 нуклеотидов в первом
интроне аллеля AMGX
Aллель AMGY
Аллель AMGX, расположенный в Х-хромосоме, на 6
Y-хромосома
нуклеотидов
короче в результате делеции
в первом
Aллель AMGX
интроне.
106 п.н.
Х-хромосома
112 п.н.

25. Технология определения пола эмбрионов

Микробиопсия
трофобласта
Выделение ДНК
ПЦР с праймерами
к АМG
При идентификации пола, определяются фрагменты
обоих аллелей длиной,
112 (АМGY)
К
1соответственно,
2
и 106 (AMGX ) пар нуклеотидов.
112
106
Электрофорез продуктов ПЦР
♀
♂

26. ПЦР- диагностика качества продуктов питания

Микробное загрязнение продуктов
Выявление в пищевых продуктах трансгенов
Определение посторонних примесей
биологического происхождения, снижающих
качество продукции

27.

Молекулярная археология и палеонтология изучение ДНК из найденных при раскопках какихлибо содержащих ее древних объектов.
Самой древней ДНК –
120…135 млн. лет.

28.

ПЦР в гидрогеологии – исследование
перемещения подземных вод.
ПЦР-анализ проб воды
ДНК

29.

Конец