Полимеразная цепная реакция

1. ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения

Российской Федерации
Кафедра молекулярной биологии и медицинской биотехнологии МБФ
Практическая работа
«Полимеразная цепная реакция»
Занятие I
2018

2.

В 1869г. И. Мишером была открыта ДНК.
В 1944г ряд экспериментов О. Эвери, К. Мак-Леода и М.Мак-Карти по
трансформации бактерий
В 1949–1951 гг. группой биохимика Э. Чаргаффа были сформулированы
количественные соотношения между различными типами азотистых оснований в
составе нуклеотидов ДНК и получили название «правила Чаргаффа. Количество
аденина (А) равно количеству тимина (Т), а гуанина (Г) – цитозину (Ц): А=Т, Г=Ц.
1953 г. - расшифровка структуры ДНК и определение принципа комплементарности
Дж. Уотсоном и Ф. Криком.
1955г. - А. Корнберг открыл фермент, который назвал ДНК-полимеразой. Этот
фермент способен удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры),
присоединяя к 3'-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого
необходимо, чтобы праймер был связан с комплементарной цепью ДНК (матрицей).
В 1971г. Клеппе и соавт. представили данные, касающиеся состава ингредиентов
реакционной смеси, и принципы использования коротких искусственно
синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК.
В 1975г. - Т. Брок и Х.Фриз открыли Thermus aquaticus, а в 1976 г. из нее была
впервые выделена Taq-полимераза.
1983-1984 гг. - К. Мюллис начал использовать Taq-полимеразу вместо неустойчивой к
высоким температурам ДНК-полимеразы. К. Мюллис совместно с Ф. Фалуном
разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.
2

3. Значение для современной науки и медицины

Решение самых различных научных задач
Генотипирование организмов
Диагностика инфекционных заболеваний
Диагностика генетических заболеваний и
генетической предрасположенности
Установление родства, идентификация
личности
Анализ древних останков, криминалистика
Детекция ГМО

4. Основные достоинства ПЦР

Высокая чувствительность
Высокая специфичность
Проста в исполнении
Нет необходимости в выделении или
сложной очистке матричной ДНК
Возможность работы с практически любым
биологическим материалом

5. Стадии ПЦР

Денатурация (94°C)
– Обеспечивает разделение нитей ДНК
Гибридизация (отжиг) праймеров на матрице (45-65°C)
– Формирует структуры узнаваемые ДНК-полимеразой
Синтез (удлинение) цепи (72°C)
– Происходит синтез комплементарных цепей и удваивает
число молекул ДНК мишени

6. Схема ПЦР

1 копия
(матрица)
Денатурация
Отжиг праймеров
Синтез
2 копии

7.

8. Основные причины выхода на «плато»

истощение субстратов (дНТФ и праймеров)
падение активности реактантов (дНТФ и фермента)
накопление ингибиторов, включая пирофосфаты и
ДНК-дуплексы
конкуренция за реактанты неспецифическими
продуктами или праймер-димерами
концентрация специфического продукта и неполная
денатурация при высокой концентрации продуктов
амплификации.

9. Основные модификации PCR

Стандартная ПЦР
ПЦР с
«горячим
стартом»
(hot start)
Аллельспецифическая
ПЦР (SSP-PCR)
ПЦР ПДРФ
(RFLP-PCR)
Long-PCR
Гнездовая ПЦР (nested PCR)
Множественная ПЦР (multiplex PCR)
Количественная ПЦР в реальном времени
Асимметричная ПЦР (single-sided PCR)
ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией (OT-PCR)
ПЦР in situ
Алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР был
разработан К. Мюллис совместно с Ф. Фалуном.
9

10. ПЦР с «горячим стартом»

10

11. Аллель-специфическая ПЦР (SSP-PCR)

5’
3’
3’
5’
5’
3’
комплементарность праймера аллелю
– амплификация
отсутствие комплементарности
праймера аллелю – нет амплификации
11

12. Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР (ПЦР-ПДРФ) на примере эндонуклеазы рестрикции EcoR I

EcoR I
G↑AATTC
CTTAA↓G
12

13. Tetra amplification refractory mutation system polymerase chain reaction (tetra-ARMS PCR)

13

14. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR ) - это семейство методик количественной ПЦР со следующими чертами: 1. Флуоресцентная

регистрация накопления вещества;
2. Определение выхода продукта реакции после каждого цикла
амплификации;
3. Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР;
4. Определение относительной концентрации субстрата на основании
анализа этой кривой.
Использование интеркалирующих агентов (неспецифическая
система детекции)
14

15. Digital PCR

• Позволяет определять абсолютное количество копий ДНК-мишени в
образце.
• Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
• Проводится множество параллельных реакций на малом количестве
материала каждая.
• Для коррекции искажений, возникающих в результате возможного
попадания в лунку более 1 молекулы ДНК применяется поправка,
учитывающая распределение Пуассона.
https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/life-science/pcr/digital-pcr.html
15

16. Digital PCR (2)

Решаемые задачи:
•Количественная оценка биомаркеров рака. Мутации, ассоциированные с
онкологией, часто не удается детектировать из-за их низкой концентрации
по сравнению с фоновой ДНК дикого типа в том же образце.
•Точная количественная оценка вирусной нагрузки.
•Определение количества копий гена (CNV).
•Валидация и количественная оценка библиотек NGS. Используя
технологии цифровой ПЦР, можно качественно и количественно оценить
созданную библиотеку для наиболее эффективного использования
секвенаторов.
•Анализ экспрессии генов. Капельная цифровая ПЦР позволяет
количественно определить уровень экспрессии гена: возможна оценка
минимального 10% изменения экспрессии, в том числе и при низких
концентрациях.
•Стандартизация экспериментов и сравнение результатов, полученных в
разных лабораториях.
16

17. Принцип метилчувствительной ПЦР

17

18. Генетический полиморфизм

Геном человека
содержит 3 млрд пар
оснований (п.о.)
…G G T A A C T G…
полиморфизм
…G G C A A C T G...
Люди могут иметь альтернативные основания в определенном
положении ДНК:
это однонуклеотидный полиморфизм (Single Nucleotide
Polymorphism, SNP). В таком случае, говорят о существовании
двух вариантов (аллелей): T и С.
Геном человека содержит 1 SNP на ≈300 п.о.
Сосуществование в пределах популяции двух (содержащих SNP)
или нескольких различных наследственных форм того или иного
гена - его вариантов (аллелей) - называется генетическим
полиморфизмом.
18

19. Полиморфные участки

Полиморфизмы являются нейтральными
мутациями
Большинство полиморфизмов биаллельны, но
встречаются исключения
Среди полиморфизмов, кроме замен,
встречаются делеции, инсерции и пр.
Полиморфизмы могут находится в любой
части генома
19

20. Влияние полиморфизмов в зависимости от положения в гене

Влияние на регуляторные
последовательностиизменение уровня
экспрессии
Промотор
5’-UTR
Экзон 1
Изменение связывания
транскрипционных факторов с
последовательностью ДНКусиление или ослабление
транскрипции- увеличение
или уменьшение уровня
продукта в организме
Интрон
Экзон 2
3’-UTR
Изменение кодирующей
последовательности -сдвиг
рамки считывания, замена
нуклеотида и т.д.- синтез
измененного продукта
20

21. Задача исследования

Выявление факторов
генетической
предрасположенности
к заболеванию
21

22. Этапы работы

Выбор полиморфных участков генов
(PubMed)
Выбор метода исследования (PubMed)
Подбор праймеров и рестриктаз (Vector
NTI, Primo, BLAST и др.)
Подбор условий
Постановка серии экспериментов
Обработка результатов
22

23. База данных OMIM

23

24. База данных OMIM

Cloning- информация о структуре и клонировании
мРНК, о структуре белкового продукта гена
Gene functions- функции белкового продукта в
организме
Biochemical features- показатели в организме,
например, уровень в плазме крови
Mapping- картирование гена, наличие псевдогенов
Molecular genetics- ассоциация различных
вариантов этого гена с развитием заболеваний
References- перечень статей, которые были
использованы при написании этого раздела
Contributors, creation date, edit historyинформация о том кто и когда создал и обновлял
этот раздел
24

25. База данных SNP

25

26. База данных SNP

26

27. База данных SNP

27

28. База данных SNP

Для того, чтобы найти необходимый
полиморфизм нужно знать его код
База данных SNP содержит данные о
различных названиях полиморфизма, что
необходимо для поиска литературы в
других базах данных
Данные о секвенировании участка гена,
содержащего этот полиморфизм
Карту гена с указанием локализации
полиморфизма
Распределение аллелей и генотипов
полиморфизма в различных популяциях
28

29. База данных Gene Bank

29

30. Требования к праймерам

Оптимальная длина праймеров
составляет 18-з0 н.
GC –состав праймеров должен
находиться в пределах 35-65 %
(оптимально 45-55%) и быть одинаковым
у всех праймеров в смеси. Основания G и
C должны быть равномерно
распределены по всей длине праймера
Необходимо избегать
самокомплементарности праймеров,
образования шпилек и димеров
праймеров
30

31. Компьютерные программы для подбора праймеров

BLAST
Primo
Другие
инструменты
Vector NTI
Подбор
праймеров
31

32. Vector NTI

Создание, описание и анализ ДНК и
белковых последовательностей
Представление и хранение результатов
поиска в BLAST
Дизайн праймеров для ПЦР, клонирования,
секвенирования и гибридизации
Выравнивание ДНК и белковых
последовательностей
Поиск в базе данных NCBI, просмотр и
сохранение данных о последовательностях
ДНК и белков, различных ссылок
Сборка фрагментов, полученных
хроматографией, в контиг
С 2008 года программа стала платной
32

33. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

Сравнение результатов секвенирования
Идентификация видов
Определение локализации доменов
белков
Определение филогенетического древа
Картирование ДНК
Дизайн праймеров
33

34. BLAST

34

35. BLAST

35

36. BLAST

36

37. BLAST

37

38. BLAST

38

39. Primo

39

40. Подбор программы амплификации

Определяется для каждой конкретной пары
(или большего числа) праймеров
Расчет Тм с помощью олигонуклеотидных
калькуляторов, либо с помощью формулы Тм
=4(G+C)+2(A+T)-5
Обычно температуру отжига праймеров задают
на 5оС ниже расчетной
Оптимальное количество циклов 30-40.
95°С
95°С 95°С
95°С
72°С
72°С
62°С
72°С
64°С
N циклов
10 циклов
58°С
20 циклов
40

41. Критические компоненты смеси

Праймеры
Буфер
ДНК
Трис-HCl
MgCl2
Смесь
dNTP
Полимераза
Некритические компоненты смеси : DMSO, глицерин, моноклональные
антитела, пирофосфотаза и пр.
41

42. Состав обычной ПЦР смеси

Компонент
Концентрация в 1
реакции
Концентрация в
стоковом растворе
Буфер
1x
10x
MgCl2 (1-4 mM)
2.5mM
25mM
dNTP’s (50-200 µM)
0.2mM
2mM
Праймеры fwd и rev
0.1µM
10µM
0.05u/µl
5u/µl
Полимераза
H2O
довести до требуемого
объема
42

43. Диметилсульфоксид (DMSO)

Биполярный апротонный
растворитель
Ингибирует спаривание
комплементарных
молекул ДНК
43

44. Моноклональные тела

Действуют на активный центр
полимеразы
Ингибируют неспецифическую
активность полимеразы
44

45. Пирофосфатаза

Катализирует
превращение
пирофосфата,
побочного
продукта ПЦР, до
ортофосфата
Повышает выход
ПЦР
45

46. Тетраметиламмоний хлорид (TMAC)

Стабилизирует АТ пары
Повышает выход и
специфичность ПЦР
46

47. Почему ПЦР может «не пройти»?

Плохой дизайн праймеров
Неверная концентрация праймеров
Слишком много dNTP или деградированные dNTP
Не перемешанный раствор MgCl2
Неверная концентрация MgCl2
Наличие ингибиторов
Плохое качество минерального масла
Слишком много фермента
Ошибки в программе амплификатора
Недостаток или избыток матрицы

48. Контаминация

При проведении каждого эксперимента
необходимо параллельно использовать
«отрицательный контроль» (в пробирку не
добавляется ДНК матрицы)
Добавление ДНК в смесь должно
происходить в отдельном ламинаре,
желательно, в другом помещении
Амплификаторы и приборы для
проведения электрофореза должны
находиться вне «чистой зоны»
Постановка ПЦР должна осуществляться
строго в перчатках
После постановки ПЦР рабочую
поверхность ламинара, вортекс, пипетки и
пр. необходимо тщательно обработать
спиртом, а ламинар обработать
ультрафиолетом
48

49. Спасибо за внимание!

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!
49

50.

Дополнительные слайды
50

51. Методы амплификации ДНК, не требующие термоциклирования

петлевая изотермическая амплификация (Loop-mediated isothermal
amplification, LAMP)
амплификация по типу катящегося кольца (rolling circle amplification, RCA)
амплификация с замещением цепей (strand displacement amplification, SDA)
реакция транскрипционной амплификации (nucleic acid sequence based
amplification, NASBA)
изотермическая амплификация, инициируемая одним праймером (single
primer-triggered isothermal amplification)
геликаза-зависимая амплификация (helicase dependent amplification HDA)
кросс-праймерная амплификация (сross-priming amplification, CPA)
51

52. Петлевая изотермическая амплификация

52