Микробиология холеры

1. Микробиология холеры

Врач-бактериолог лаборатории холеры Пономарева А.С.

2.

Холе́ра (от древнегреческого χολή «желчь»
и ῥέω «теку»)
Холера – острая инфекционная болезнь с
диарейным синдромом, фекально-оральным
механизмом передачи возбудителя, водным,
пищевым и контактно-бытовым путями
распространения инфекции.

3.

История открытия холерных вибрионов
Древние тексты описывающие холеру
500-400 лет до н.э.- упоминания на Санскрите
500 лет до н.э.- Гиппократ
200 лет н.э. - Гален
900 лет н.э.- Рази, Исламский врач
Санскрит, арабские и китайские тексты,
написанные около 2000 лет назад

4.

История открытия холерных вибрионов
1854 г. Филлипо Пачини, монография «Микроскопические исследования и паталогоанатомические заключения по азиатской холере».
1854 -1855 гг. Джон Сноу, работы по эпидемиологии холеры
1883 г. Роберт Кох выделил возбудителя в чистой культуре, описал его свойства, рекомендовал
среды для выращивания вибриона
1984 г. Юридическая секция Международной комиссии по бактериологической номенклатуре
вынесла решение называть холерный вибрион «Vibrio cholerae Pacini, 1854»

5.

6.

7.

В соответствии с определителем Берджи холерные вибрионы включены в
Класс, y- Proteobacteria, семейству Vibrionaceae, родуVibrio, виду cholerae,
который включает как патогенные, способные вызывать заболевания,
склонные к эпидемическому и пандемическому распространению, так и не
патогенные, безопасные для человека или обусловливающие спорадические
случаи диарей. Возбудитель Vibrio cholerae относится ко II группе
патогенности
Известно более 200 серологических групп холерных вибрионов, из которых
лишь холерные вибрионы О1 серогруппы (классического – V. cholerae cholerae
и эльтор – V. cholerae eltor биоваров) и О139 серогрупы (V. cholerae O139)
являются возбудителями эпидемической холеры

8.

Vibrionaceae
Семейство
Shewan and Veron, 1965
Типовой род Vibrio
Pacini, 1854
45 видов вибрионов, в т.ч.
патогенных для человека:
V. alginolyticus;
V. cincinnatiensis;
V. damsela 2);
V. fluvialis;
V. furnissii;
V. harveyi;
V. hollisae;
V. metschnikovii;
V. mimicus;
V. parahaemolyticus;
V. vulnificus
Типовой вид
Vibrio cholerae
Другие роды:
Aeromonas
Kluyver et Van Niel,
1936;
Enhydrobacter
Staley et al,1987;
Photobacterium
Beijerinc,1889;
Plesiomonas
Habs et Schubert,
1962
Серогруппы
Vibrio cholerae
О1
О139
non
O1/O139
Биовары
V.cholerae O1
V. cholerae
cholerae
V. cholerae
eltor
Серовары:
Inaba,
Ogava,
Hikojima
Возбудители
гастроэнтеритов и
системных инфекций
V. cholerae O2-O138; O140-O206
(по международной
классификации)
V. cholerae O2-O83
(по отечественной классификации)
3)

9.

10.

Холерные вибрионы грамотрицательные аспорогенные
полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки,
варьирующие в размерах (0,2-0,6 мкм в ширину и 1,53,0 мкм в длину), с одним полярно расположенным
жгутиком, благодаря которому очень подвижны.

11.

Холерные вибрионы хорошо растут на щелочных питательных средах pH
7,6-8,6, Оптимальная температура выращивания – 35-38ºC. На щелочных
жидких питательных средах - мясо-пептонном бульоне (МПБ) и 1%
пептонной воде (ПВ) – через 3-5 ч инкубирования при 37ºC наблюдается
образование нежной пленки на поверхности и равномерное помутнение
среды.
В полужидком (0,3%) агаре –равномерный рост во все стороны от укола,
достигающийчерез 24-36 часов стенок пробирки.
На пластинках щелочного мясо-пептонного агара (МПА) холерные
вибрионы в типичной S-форме через 16-18 ч культивирования образуют
гладкие, плоские, прозрачные, влажные с ровным краем колонии.
На элективной среде TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar) на
зеленом фоне среды колонии вибрионов круглые, гладкие с ровным
краем, плоские, желтого цвета.
Могут встречаться атипичные колонии – шероховатые (R-форма) и
мукоидного типа, представляющие собой измененные формы холерного
вибриона.

12.

Холерные вибрионы обоих биоваров (V. cholerae cholera и V. cholerae eltor) имеют
общий О-антиген, относятся к О1 серологической группе и представлены тремя
сероварами: Огава, Инаба и Гикошима.
Серовар Гикошима представляет собой разнопроцентную смесь сероваров Огава и
Инаба.
Принадлежность культур V. cholerae к О1 серогруппе определяется по результатам их агглютинации
видоспецифической холерной сывороткой О1. Вариантоспецифичность культуры устанавливается по
результатам РА с холерными сыворотками Огава и Инаба. Холерные вибрионы, реагирующие в
одинаковых титрах с сыворотками обоих серовариантов – Инаба и Огава, относятся к серовару Гикошима.
Вибрионы О139 серогруппы по своим морфологическим и биохимическим свойствам
не отличаются от вибрионов О1 серологической группы. Единственным отличием
является агглютинация О139 сывороткой.

13.

Что такое холера?
Кишечная инфекция с тяжелой диареей
вызванной холерным токсином вибриона

14. V. cholerae

Растет в соленой и пресной воде
Может выжить и размножаться в
солоноватой воде путем заражения
веслоногие и ракообразные
Известно более 200 серогруп,
основанных на O-антиген
В основном только O1 и O139 группы
могут быть токсигенными и являться
причиной заболевания холерой
Два биотипа O1 серогруппы –
классический и Эль-Тор

15.

Передается фекально оральным путем
Эндемичные страны - Индия и Бангладеш
Может сохраняться в моллюсках или
планктоне
7 пандемии с 1817 г.: первые 6 вызваны
классическим биоваром холерного
вибриона, 7 пандемия- биовар Эльтор
В 1993 г. холера появляется в Бенгалии, и
вызвана она холерным вибрионом
биовара Эльтор, O139 серогруппы – и
некоторыми авторами характеризуется как
начало 8 пандемии.

16.

Холерные вибрионы, как и другие представители родаVibrio:
ферментируют до кислоты глюкозу в аэробных и анаэробных условиях,
декарбоксилируют лизин и орнитин,
не обладают дигидролазой аргинина,
относятся к 1ферментативной группе Хейберга-Смита,
расщепляют до кислоты сахарозу, маннозу, маннит, и не разлагают арабинозу.
Вибрионы разжижают желатину, казеин, фибрин;
вырабатывают лецитиназу, липазу, нейраминидазу, хитиназу, пенициллиназу,
индофенолоксидазу, лизин- и орнитиндекарбоксилазы, нитратредуктазу, ßгалактозидазу.

17.

нация
Ферменация глюкозы
V.cholerae в аэробных
и анаэробных
условиях
(среда Хью-Лейфсона).
Ферментация V.cholerae
аминокислот лизина,
орнитина и аргинина на
бульоне Мюллера с
аминокислотами.
Ферментация сахаров
V.cholerae на средах Гисса.

18.

Видовая принадлежность микроорганизмов рода Vibrio определяется на основании их
биохимической активности. Кроме того, с этой целью применяются ускоренные
методы идентификации, в т.ч. анализ профиля константных белков микробной клетки
с использованием
-MALDI-ToF масс-спектрометрии
-Микрообъемная биохимическая идентификация с использованием API-тестов
ПЦР.

19.

Типичные штаммы холерных вибрионов в S-форме агглютинируются видо- и
вариантоспецифической сыворотками не меньше, чем до 1/2 титра.
Культуры в R-форме взаимодействуют с холерной RO-сывороткой, при этом агглютинация
с видоспецифической холерной сывороткой О1 серогруппы снижена или отсутствует
совсем.
При выделении атипичных культур проводятся дополнительные исследования.
Штаммы, агглютинирующиеся диагностическими сыворотками О1, RО, Инаба, Огава ниже
1/2 титра или агглютинирующиеся только RО сывороткой (с полной или частичной
утратой способности лизироваться диагностическими холерными бактериофагами)
изучаются в тестах, определяющих их принадлежность к роду Vibrio

20.

Слабо агглютинирующиеся холерной О1 сывороткой и фагорезистентные культуры подлежат
исследованию в реакциях непрямой гемагглютинации (РНГА), иммобилизации вибрионов (РИВ),
полимеразной цепной реакции (ПЦР), флюоресцентно-серологическим методом (МФА), или адсорбцией
по Кастеллани.
Культура, агглютинирующаяся сывороткой О139, относится к V. cholerae О139 серогруппы. Если культура
не агглютинируется холерными сыротками О1, О139, но по совокупности признаков относится к виду
холерных вибрионов, проводится ее изучение в реакции агглютинации с набором диагностических
холерных сывороток О2-О83 серогрупп по отечественной классификации. Кроме того, штаммы V.
cholerae не О1/О139 серогрупп подвергают типированию бактериофагами диагностическими холерными
ТЭПВ 1-7.
Энтеропатогенные холерные вибрионы не О1/О139 групп относятся преимущественно к
О2, О5, О6, О8, О9, О14, О17, О22, О24, О28, О34, О36, О41, О42, О47,О50 серогруппам и,
как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.
Для определения принадлежности вибрионов к галофильной группе проводятся
дополнительные исследования с разным процентным содержанием NaCl в питательной среде.
Хранение культур вибрионов проводится в лиофилизированном (высушенном) состоянии, так
же возможен хранение при температуре -70 ⁰С в жидкой среде под глицерином

21.

Основными признаками дифференциации биоваров холерных вибрионов являются проба
с холерными диагностическими фагами классическим и эльтор, реакция агглютинации с
куриными эритроцитами или эритроцитами морской свинки, тест на чувствительность к
50 ед/мл полимиксина В и образование ацетилметилкарбинола в реакции ФогесПроскауэра.

22.

Биологические свойства холерных вибрионов
№
Признак
V.
сholerae
asiaticae
Классиче
ский
биовар
1
Чувствительность к
полимиксину В (50 ЕД)
+
2
Реакция Фогес-Проскауэра
± (чаще –) ± (чаще +)
3
Чувствительность к классическому холерному
бактериофагу С
+
—
—
4
Чувствительность к холерному бактериофагу eltor II
—
+
—
5
Гемолиз эритроцитов барана
—
+
—
6
Агглютинация эритроцитов кур
—
+
(чаще +)
+
(чаще +)
7
Нитрозоиндоловая проба (ферментация белков с
образованием индола, восстановление нитратов в
нитриты)
—
+
+
V.
cholerae
Eltor
Биовар
Эльтор
V.cholerae
O139
(Бенгал)
—
—
± (чаще +)

23. Факторы патогенности V.cholerae

Подвижность и хемотаксис. С помощью этих двух свойств вибрион преодолевает
слизистый слой и вступает во взаимодействие с эпителиальными клетками;
Факторы адгезии и колонизации спомощью которых вибрион прилипает к
микроворсинкам и колонизирует слизистую оболочку тонкого кишечника;
Ферменты: муциназа, нейраминидаза, лецитиназа и другие способствуют адгезии и
колонизации, так как разрушают вещества, входящие в состав слизи;
Экзотоксин-холероген является главным фактором патогенности V.cholerae и
обуславливает патогенез холеры. Молекула холерогена имеет молекулярную массу 84
кДа и состоит из 2-х фрагментов – А и В. Собственно токсическую функцию выполняет
пептид А;
Помимо холерогена, холерный вибрион синтезирует и выделяет фактор, повышающий
проницаемость капилляров;
Эндотоксин, представляющий собой липополисахарид. Он обладает сильным
эндотоксическим действием.

24. Основные звенья патогенеза холеры

холероген
мембранотоксин
активация
стимуляция продукции
аденилатциклазы
простогландинов
эндотоксин
повышение прониц.
воздей-е
мембран энтероцитов
на слиз.
и капилляров
Обильная водянистая диарея
желудка
обильная рвота
из кишечника
и желудка,
рвота
«фонтаном»
Развитие обезвоживания с выраженной потерей электролитов
дегидратация
тканей
замедление тока
крови
нарушение
гипокалиемия,
гемодинамики
гипонатриемия
Судороги, цианоз, гиповолемический шок, острая почечная недостаточность

25.

26. Вирулентные факторы

Патогенез V. cholerae
Вирулентные
факторы
Токсины и ферменты
- термостабильный эндотоксина
- энтеротоксинов (экзотоксин [Холерный
токсин CT])
CT антигенно и фармакологически идентичны
во всех серо и биотипах

27. Структура холерного токсина

28. Структура холерного токсина

After cleavage, the A1 and A2 polypeptides remain
linked by a disulphide bond.
• A и B подразделения
связаны через C-конечная
Субблок А2, который
вводится через
Центральный поры B
пентамера.

29. Как работает холерный токсин

Биологическая активность CT зависит от
привязки B пентамера для конкретных
рецепторов GM1
Ганглиозиды.Биологическая активность CT
зависит от привязки B пентамера для
конкретных рецепторов GM1 Ганглиозиды.
• Internalization is initiated once
CT-GM1 complexes cluster which
then invaginate to form apical
endocytic vesicles.

30. Как работает холерный токсин?

Эти пузырьки введите сотовой
оборота путей, ведущих к Транс
Гольджи сети (TGN). Токсин затем
перемещает Ретроградная через
бачок Гольджи ER. Однажды в ER,
CT обрабатывается для того чтобы
активировать А1 пептид, который
затем целей базолатеральной
мембраны (гетеротримерные
ГТФазы и аденилатциклазы
(переменного тока)).

31.

Как работает холерный токсин?
Аденилатциклаза (AC)
активируется обычно
регламентационный
протеин (ОО) и ГТУ;
Однако активация обычно
краткие, потому что
другой
регламентационный
протеин (Gi), гидролизует
ГТФ.
NORMAL CONDITION

32. Как работает холерный токсин

A1 фрагмент катализирует
приверженность
регламентационный протеин,
образуя Gs-ADPR, от которого
нельзя гидролизованный GTP
АДФ-рибоза (ADPR). Так как
гидролиз ГТФ является событием,
которое инактивирует
аденилатциклаза, фермента
остается постоянно
активированным.
CHOLERA

33. Как работает холерный токсин?

Таким образом чистый
эффект токсин является
причиной лагерь
производится на аномально
высокий уровень, который
стимулирует мукозные клетки
перекачивать большие
объемы Cl - в кишечного
содержимого.

34. How Does Cholera Toxin Work?

Как работает
холерный
токсин
H2O, Na + и других электролитов
следовать за счет осмотического и
электрические градиенты, вызванные
потерей Cl. Потерянные H2O и
электролитов в слизистой клетки
заменяются из крови. Таким образом
токсин поврежденные клетки
становятся насосы для воды и
электролитов, вызывая диарею, потеря
электролитов и обезвоживания, которые
характерны для холеры.

35. How Does Cholera Toxin Work?

Как
холерный
Howработает
Does Cholera
Toxin токсин
Work?
• Инактивирует ГТФазы функция G-протеин
рецепторов в кишечных клетки белки G
застрял в «На «позиции 100 раз увеличение в
лагере активация ионных каналов потока ионов
и воды следует

36.

37.

38.

Чувствительность к следующим препаратам с помощью диско-диффузионного
метода :
Стрептомицин (300 мкг) Sm
Ампициллин (10 мкг) Am
Хлорамфеникол (30 мкг) Ch
Ципрофлоксацин (5 мкг) Cp
Гентамицин (10 мкг) G
Канамицин (30 мкг) К
Фуразолидон (300 мкг) Fr
Тетрациклин (30 мкг) T
Рифампицин (5 мкг) Rif
Триметомприм –
Сульфаметоксазол (1,25/23,75 мкг) Со
Триметомприм (5 мкг) Т
Вибриостатический агент (150 мкг) О/129

39.

V.cholerae O1 № И-1337 ( г. Владивосток, 1999 г.)
Am
G
К
Rif
Cp
Fr
О/129
Tm
Sm
Ch
T
Co
V.cholerae O139 №180
( г. Новосибирск,1998 г.)
G
К
Am
Ch
Sm
T

40.

За последние 10 лет в изучении молекулярной биологии
холерного вибриона произошли значительные события:
- открытие филаментозного фага, кодирующего холерный
токсин
- определение 2-х хромосомной структуры генома холеры
- расшифровка полной геномной последовательности
V.cholerae

41.

В 2000г. Публикация полной геномной
последовательности холерного вибриона, открыла
новую страницу в изучении данного микроорганизма.
Heidelberg JF, Eisen JA, Nelson WC, Clayton RA, Gwinn ML,
Dodson RJ, Haft DH, Hickey EK, Peterson JD, Umayam L, et al.:
DNA sequence of both chromosomes of the cholera
pathogen Vibrio cholerae. Nature 2000, 406:477-483

42.

•Геном холерного вибриона состоит из двух кольцевых
хромосом

43.

Патогенные (эпидемически опасные) штаммы холерного вибриона
характеризуются способностью продуцировать термолабильный
холерный энтеротоксин (холероген) – основной фактор
вирулентности микроорганизма, кодируемый генами ctxAB,
входящими в состав интегрированного в хромосому филаментозного
бактериофага CTX. По структуре гена субъединицы В (ctxB)
выделяется ряд генотипов холерного токсина, в частности сtxB1
(специфичный для классического биовара), ctxB3 (специфичный для
биовара эльтор). В последние годы обнаружены атипичные варианты
вибриона эльтор с измененным геномом: фенотипически они
соответствуют биовару эльтор, но содержат в геноме классическую
аллель гена холерного токсина – ctxB1. Кроме того, эпидемически
опасные штаммы холерного вибриона формируют токсинкорегулируемые пили адгезии (ТСР), играющие основную роль в
адгезии и колонизации вибрионом слизистой оболочки тонкого
кишечника. Биосинтез токсин-корегулируемых пилей находится под
контролем кластера генов tcp, входящего в состав «острова
патогенности» VPI.

44.

Эпидемически опасные штаммы холерного вибриона содержат
профаг CTXφ, внедренный в attRS сайт хромосомы. Профаг CTXφ
размеом 6,9 т.п.н. имеет две области коровую и RS2.

45.

Двух компонентный токсин V.cholerae
Токсический регион выделен красным, участок связываниясиним цветом