Роль сателлитсвязывающих белков в высокоуровневой организации хроматина

1. Роль сателлитсвязывающих белков в высокоуровневой организации хроматина

2. Уровни упаковки генома

Интерфаза
Уровни упаковки генома
?
Двойная спираль
2 нм 1х
10 нм фибрилла
10 нм 6х
30 нм фибрилла
30 нм фибрилла 40х
Петельные домены
Петельные домены 700х
Фрагмент
конденсированной
хромосомы
Метафазная
хромосома
Из статьи:
Controlling the double helix
Gary Felsenfeld and Mark Groudine
Nature 421, 448-453

3. Хромосомы типа ламповых щеток

4.

Доменная гипотеза организации эукариотического генома
Весь геном построен из однотипных блоков - доменов, которые
могут включать один или несколько генов
Домены в целом находятся под контролем особых регуляторных
систем, которые контролируют их транскрипционный статус на уровне
упаковки (более компактной или менее компактной) всего домена в
интерфазной хромосоме
Активный домен
Неактивный домен

5.

Insulator elements organize the chromatin fiber in the nucleus by establishing separate compartments of
higher-order chromatin structure. (A) Domains of open chromatin (yellow nucleosomes) are flanked by
insulators (pink, blue and green spheres) that interact together to form a loop. (B) Diagram showing part of a
nucleus with compartmentalized chromatin, anchored in part to the nuclear periphery by interactions of the
insulators with the nuclear lamina (red lines).

6.

Experimental approach
Nuclei
Nuclear matrix
DNase I
0,2 M (NH4)2SO4
Q-sepharose
ion exchange
chromatography
10mM TrisHCl pH=9,
EDTA, Triton X-100, DTT
Extraction
SDSGel mobility shift assay
(GMSA, retardation)
GMSA
+
Immunoprecipitation
Immunoblotting
Hipershift in GMSA
Immunofluorescence
Polyclonal
Antibodies
Affinity
Chromatography
MALDI
(mass spectrometry)

7.

Mus
I. Mus musculus
Homo
II. Homo sapiens

8.

Saf-a/hnRNP U
a
b
c
d
Lobov et al., 2000

9.

- satMa FISH
- Saf-a IF
- DAPI
Lobov et al., 2000

10.

- Saf-a
- CENP-B
- DAPI

11.

Saf-a/hnRNP U domain structure

12.

Saf-a/hnRNP U specifically interacts with
-actin in the nucleus
Actin and hnRNP U cooperate for productive transcription by RNA Polymerase II
Kukalev A et al., Nature, 2005

13.

14.

15.

Saf-a/hnRNP U co-precipitated with b-actin
DNase I
beads
+ nuclear
extract
SDS Page

16.

Actin binds Saf-a/hnRNP U in vivo
0.5 mM DSP
(dithiobissuccinimidylpropionate)
Nuclear extract
preparation
8M Urea
DNase I
Pull down

17.

Saf-a/GFP fusion proteins
Saf-a FL
1-823 a/a

18.

Actin co-localised with fusion Saf-a-GFP in HeLa cells
Saf-a FL/pEGFP-N1
-Actin/Fibrillarin
Merged

19.

Saf-a N1-12/GFP fusion protein
Saf-a N1-12
1-250 a/a - DNA-binding region
Saf-a 21-22/pEGFP-N1
DAPI
Merged

20.

Saf-a 21-22/GFP fusion protein
Saf-a 21-22
250-550 a/a - middle part, potential NTP binding domain
Saf-a 21-22/pEGFP-N1
DAPI
Merged

21.

Saf-a 31-N3/GFP fusion protein
Saf-a 31-N3
550-823 a/a - RNA-binding region
Saf-a 31-N3/pEGFP-N1
DAPI
Merged

22.

QRTQK motif presents in other nuclear and cytoplasmic proteins

23.

DNase fingerprinting
GMSA
Saf-a/hnRNP U DNA binding
Southwestern blot
Lobov et al., 2001

24.

Computer models of CEN and periCEN DNA fragments
Ulanovsky L.E., Trifonov E.N. 1987
Estimation of wedge components in curved DNA
Nature 326:720-726

25.

26.

27.

a
b
c
Lobov et al., 2001

28.

80 Kb CEN region of NeoCEN10
CEN models
Sullivan et al., 2001

29.

Podgornaya et al., 2003

30.

Identifying Functional Neighborhoods within the Cell Nucleus: Proximity Analysis of Early S-Phase
Replicating Chromatin Domains to Sites of Transcription, RNA Polymerase II, HP1γ, Matrin 3 and SAF-A
Malyavantham ……Berezney, J Cell Biochem. 2008

31.

transcription
site
HP1γ
euchromatin

32.

rod domen
Multiple
Alignment
Rod-domain like motifs
in TRF2
TRF2 sp domen
Voronin et al., 2003

33.

Homo sapiens
LMP
HMP
F
mM NaCl
ЯМ человека связывает центромерную альфасателлитную ДНК

34. Mus musculus

NEx
50
50 75 50
NM
75 150 50 75
50 75 50 75 150 50 75
E.coli/MiSat
ЯМ мыши связывает ДНК минорного сателлита

35. Homo sapiens

ЯМ человека связывает прицентромерный
сателлит 3

36. Аффинная хроматография

а
б
Q400
205
116
97
84
66
55
45
36
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5 67
8 9 10 11
Белок 70 кДа ЯМ человека связывает а-сат ДНК

37. Получение АТ

Q400
205
ЯМ
ЯМQ400
116
97
84
66
55
45
36
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1
2
3
4
5
6
7
Поликлональные АТ распознают белки
массой р80, р70 и р57
8

38. Саузвестерн гибридизация

б
а
в
205
70
42
1 2 3
1
2
3
1
2
3
Среди белков,
распознаваемых
сывороткой
именно р70
отвечает за
связывание с ДНК

39. Выявление IFA детерминанты

б
а
205
205
66
116
97
84
66
55
55
45
45
116
97
84
36
36
12 3
4
5
6 7
8 9 10 11
1 2
3 4
Белок р70 обладает общей антигенной
детерминантой с белками промежуточных
филаментов
5
6 7
ДНК E. Coli

40. P70 связывает а-сат ДНК и ДНК сателлита 3

NM+
+
NM
SDS-PAGE
Detection
with AB:
SDS-PAGE
HS3
р70

41.

42. Mass-spectrometry analysis: p70=RNA-helicase p68= DEAD/H box polypeptide 5

43. Распределение р70 в ядре

HeLa
MRC5 (сульфат аммония)
а
Chr-1
p68
10
m
5 m

44. P70 по отношению к а-сат ДНК

P70 по отношению к
MRC5,
а-сат ДНК
Upregulated
epifluorescent
Single section (0.3 m)
HeLa

45. P70 по отношению к сат3

46. Определение домена локализации р70

В фибробластах и HeLa р70 находится в SC35
доменах и фибрилах между ними

47. In MRC5, p70 has been found in PML and SC35 domains

P70
Sc35
PML
In MRC5, p70 has been
found in PML and SC35
domains Upregulated

48. In HeLa S (SD), p70 has been found in SC 35 but not in PML

P70
Sc35
PML
In HeLa S (SD), p70 has
been found in SC 35 but not
in PML
HeLa S, grown in serum deprived medium

49.

CCCTC-binding factor (CTCF)
CCCTC-binding factor (CTCF)
Direct Identification of Insulator
Direct Identification of Insulator
Components by Insertional Chromatin
Components by Insertional Chromatin
Immunoprecipitation
Immunoprecipitation
Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii*
Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii*
PLoS ONE, 2011
PLoS ONE, 2011

50.

Insulator elements organize the chromatin fiber in the nucleus by establishing separate compartments of
higher-order chromatin structure. (A) Domains of open chromatin (yellow nucleosomes) are flanked by
insulators (pink, blue and green spheres) that interact together to form a loop. (B) Diagram showing part of a
nucleus with compartmentalized chromatin, anchored in part to the nuclear periphery by interactions of the
insulators with the nuclear lamina (red lines).

51. Взаимодействие хромосом в интерфазе и в митозе

52.

Mahy et al., 2002
Chevret et al., 2000
Chr 6
CEN
MMU 7
245N5
Chr 6
MHC
MHC
Chr 6
Chr 1
HS3
CEN
HS3

53.

Inter-Chromosomal Contact Networks Provide
Insights into Mammalian Chromatin Organization
Контакты в области центромера и
активного хроматина
Stefanie Kaufmann, Christiane Fuchs,
Mariya Gonik, Ekaterina E. Khrameeva, Andrey
A. Mironov, Dmitrij Frishman

54. Аггрегация хромосом

55. Межхромосомную нить наблюдали:

Wilson, 1925;
Hsu et al.,1967;
Hoskins, 1968;
Henderson et al.; 1973;
Schneider 1973;
Takayama, 1976;
Chiarelli et al. 1977;
Bennet et al., 1983;
Lavany et al., 1984
Radic et al., 1987;
Maniotis et al., 1997;
Nagele et al., 1998;
Dozortsev et al., 2000;
Saifitdinova et al., 2001
Enukashvily et al., 2005
Kuznetsova et al., 2007
Marco et al., 2008

56. Межхромосомная нить

57. Состав нити

600 А
(200 по
другим данным)
20 А
10 А
кинетохор
ДНК-аза – утрата связи
РНКаза и пепсин –
утрата эластичности

58. Состав нити

ДНК (теломерная,
интерстициальная, сателлитная)
РНК (рибосомная, мРНК)
Белки, в т.ч. чувствительные к
меркаптоэтанолу и
малорастворимые

59. ДНК – FCP повтор зяблика

Saifitdinova et al., 2001

60. M. Musculus – позднореплицирующаяся ДНК

61. M. Musculus – сатДНК межхромосомной нити

MS4
MS3
MiSat
MaSat

62. P68 в межхромосомной нити

63. Межхромосомная нить

Б
A
В
Кинетохор
Микротрубочки
межхромосомная нить
? Появление
дополнительных витков
в нити?
Анафаза
? Деформация нити,
Эластичное растяжение?
Остановка
на стадии метафазы
Енукашвили и др., 2002