ИФА диагностикасы

1. ИФА диагностикасы

ОРЫНДАҒАН: ЕСМУРАТОВА А
605-1 ТОП
ТЕКСЕРГЕН:САДВАКАС А.С

2. Жоспар

ИФА-ны жүргізу әдісі
Иммуннды реакция механизмі
ИФА сатылары
Қолданылатын конъюгат құрамы
Әдістің сезімталдығы.
ИФА классификациясы
Қатты фазалы ИФА
ИФА тікелей әдісі
Тікелей емес ИФА
Сэндвич- әдіс
Конкурентті ИФА
Ингибиторный ИФА
Иммуноферментті дақ әдісі
Нәтижені есептеу
ИФА-ның тәжірибеде қолданылуы
ИФА көмегімен анықталатын инфекциялар
Қорытынды

3. ИФА жүргізу әдісі

Серодиагностика үшін 96полистирольды айтәрізді планшеттер қолданылады,
табақшалардың қабырғаларында алдын-ала антиген адсорбирленіп алынады.
1
• Зерттелетін сарысу планшеттің табақшаларына құйылады.Сонымен қатар
гомологиялық антигенге антиденелер байланысады. Байланыспаған антиденелер
шайылып кетеді.
2
• Әрі қарай табақшаларға ферментпен белгіленген адам иммуноглобулиніне
қарсы антидене қосады. Егер зерттелетін сарысуда анықталатын
антиденелер кездессе, бұл сатыда олар белгіленген антиденелермен әсер
ететін антиген рөлінде болады.
3
• Шайылған хромогенді зат қосылған соң, табақшлардан дамып келе жатқан
боялған реакцияны көреміз. Боялу интенсивтілігі фермент және антидене санына
байланысты.Табақшадағы сұйықтықтың оптикалық тығыздығын (ОП) өлшегенде
және оны бақылау үлгісімен салыстырғанда антиденелер концентрациясы бірлік
көлемде есептеледі.

4. Иммуннды реакция механизмі

1.
2.
3.
Алғашқы реакция анықталып жатқан Ig (Ab) және қоздырғыштың
тазартылған антигенінің арасында болады, ол иммунологиялық
планшеттің лункасының беткейіне бекітіледі.
Пайда болған иммунды комплекстерді анықтау үшін екінші
иммунологиялық реакция жүргізіледі, бұл кезде антиген ретінде
байланысқан спецификалық Ig, ал антидене ретінде – конъюгат
алынады.
Әрі қарай конъюгат молекуласының ферментті бөлігімен
катализирленетін ферментативті реакция жүреді. Бұл реакцияның
субстраты түссіз зат - хромоген , реакция барысында боялған затқа
айналады.
Лункадағы боялу интенсивтілігі иммуноглобулин
сынамасының құрамындағының санына байланысты.

5.

6.

ИФА 3 арнайы сатыдан
тұрады
1. иммунды
комплекстің
2. Конъюгатттың
түзілуіне
иммунды
әкелетін,
3. Фермент
комплекспен
антиденеге
байланыс құруы
белгісінің
спецификалық
немесе бос
тіркеуші сигналға
тестіленетін
айналу сатысы.
орындармен
байланысты тану
байланысу
сатысы.
сатысы.

7. Конъюгат – бұл ферментті белгімен белгіленген антиген немесе антидене.

Сенімді конъюгат келесі қасиеттерге ие болуы керек:
- үлкен ерітіндіде қолдану үшін, жоғары антидене титрімен және
жоғары антигенге ұқсастыққа ие , сондықтан ол спецификалық емес
байланысты төмендетеді.
- Ертінді спецификалылығы жеткілікті болу керек;
- Мономерлі түрі полмерліден басымболуы крек,
- Фермент пен антидене арасында оптимальды молярлы қатынас
болады (оптимальды қатынасы 1:1);
- Конъгаттың жеткіліңті ферментативті активтілігі.

8. ИФА-ның сезімталдылығы

Әдістің сезімталдылығы ( антиген және антидене санының
минимальды анықталуы) келесі факторлармен анықталады:
антиденелер ұқсастығы, моноклональды антиденелерді
пайдалану ;
ферменттің спецификалық активтілігі ;
сигналдың интенсивтілігі;
сигналды ескру сезімталдығы.
ИФА ның орташа сезімталдығы – 10-9 – 10-12 моль.

9. ИФА классификациясы

ИФА-ның бірінші сатысында кездесетін
реагенттер типі бойынша, конкурентті және
конкурентті емес әдістер.
А) Конкурентті ИФА-да бірінші сатыда жүйеде бір
уақытта талданып жатқан байланыс және оның
аналогы болады.
Б) Конкурентті емес әдіс үшін бірінші сатыда тек
талданып жатқан байланыс және спецификалық
байланысу орталығы тән.
1.

10.

2. ИФА-ның барлық әдістері гомогенді және гетерогенді болып
бөлінеді.
Гомогенді ИФА негізіне , төмен молекулярлы
субстанцияларды анықтау үшін қолданылатын, антиген
немесе антиденемен байланысатын ферменттің
белсенділігінің ингибирленуі жатады. Ферменттің
белсенділігі антиген-антидене реакциясының қорытындысы
негізінде қалпына келеді.
Гетерогенді әдіс үшін анализді екіфазалы жүйеде қатты
фазалы- тасымалдаушы қатысуымен жүргізу тән.Міндетті
сатысы иммунды комплексті әсер көрсетпеген компоненттен
бөлу. Иммунды комплекстің бірінші сатыда түзілуі қатты
фазада жүреді – қатты фазалы әдіс деп аталады.

11.

3. Тестіленетін затты анықтау принципі бойынша:
А) Заттың концентрациясын (антигена или антидене)
тікелей анықтау бірге әсер ететін байланыс орталықтарымен
қатар жүреді. Бұл жағдайда ферментті белгі пайда болған
спецификалық АГ-АД комплексте болады. Анықталып
отырған заттың концентрациясы тіркелген сигналға тікелей
пропорционал болады.
Б) Байланысу орындарының жалпы санының әртүрлілігі
және қалған бос байланысу орталықтарына байланысты
заттың концентрациясын анықтау.Бұл кезде анықталатын
заттың концентрациясы өседі, тіркелетін сигнал төмендейді.

12.

Методы ИФА
Тип I
Тип II
Определение специфического иммунного
комплекса анализируемого соединения
Определение оставшихся свободных центров
специфического связывания
Неконкурентные
Неконкурентные
Гете
ро
ген
ные
Гетерогенные
Конкурентные
Ге
теро
ген
ные
Го
мо
ген
ные
Го
мо
г ен
ные
Твердофазные
Твер
до
фаз
ные
Гетерогенно-гомогенные
Твер
до
фаз
ные
Различные схемы проведения анализа
Гетерогенно-гомогенные

13. Қаттыфазалы ИФА

Қатты фаза ретінде ИФА –ны жүргізу
үшін әртүрлі материалдарды қолдануға
болады: полистирол, поливинилхлорид,
полипропилен және т.б. Қатты фаза
ретінде пробирка қабырғасы, 96-ай
тәрізді және басқа. планшеттер,
шариктер, нитроцеллюлозды және басқа
мембраналар.
Осы фазада антиген және антидененің
иммобилизациясы 3 жолмен жүреді:
– пассивті адсорбция, белоктар және
синтетикалық беткеймен қатты
гидрофобты әсерге негізделген;
– қатты фазаға ковалентті байланыс;
– иммунохимиялық . (коваленті емес
және адсорбционды емес байланыс).

14. ИФА-ның тікелей әдісі

1. Тақтайша лункаларында антиген немесе антидене (зерттелетін
материал)адсорбирленеді. Бақылау ретінде оң адсорбирленген
бақылау үлгісі бар лунка қолданылады, оның ішінде міндетті
түрде қалған антигендер болады.
2. «Казеин көмегімен қатты фазада қалған
байланысатын бос орындарды тежейді. (қатты
фазада конъюгаттың спецификалық емес
сорбциясының алдын алады).
3. Лункаға ферментпен белгіленген антиген немесе антидене
салынады(конъюгат). Конъюгаттың қатты фазамен байланысы
жүйенің екі компонентінің комплементарлылығы жүргенде ғана
болады. Конъюгатпен инкубациядан кейін лунканы жуады,
осылайша конъюгаттың байланыспаған бөлігін жояды.
4. Лункаға қолданылып отырған ферменке спецификалы
субстратты салады ,инкубирлейді. Оі бақылаулы лункадағы
боялу оптимальды деңгейге жеткен соң ферментативті
реакцияны тоқтатады.
5. Реакцияны көру.Алдымен реакция нәтижесін көзбен бағалайды. Боялу
интенсивтілігіне байланысты нақты нәтижені бағалау ИФАда сәйкес
светофильтрмен бағаланады. Жүргізілген анализ қорытындысы бойынша
,концентрациясынан оптикалық тығыздық графигі тұрғызылыды.

15. Тікелей емес ИФА

ИФА-ның бұл нұсқасы
спецификалық антиденелерді
анықтау үшін қолданылады.
Тақтайша лункаларында
стандартты антиген
адсорбирленеді және науқастан
алынған сарысу немесе басқа
биологиялық материал үлгісі
(жұлын сұйықтығы, сілекей және
т.б)инкубацияланады.
Қатты фазада антигенмен
байланысқан спецификалық
антиденені конъюгаттың
антиглобулині көмегімен
анықталады.

16. Сэндвич-әдіс

ИФА-ның бұл түрімен анықталатын
антигендер, антиденені
байланыстыратын бірнеше
эпитоптардан тұрады. Антидене
ферменттері антидене
байланыстыратын бірнеше
эпитоптардан тұрады.
ИФА-ның бұл түрін жүргізгенде
жоғарыспецификалық поли немесе
моноклоналды антиденелер қатты
фазада келесідй инкубирленеді.
Шаю процедурасынан кейін лункаларға ферментпен
белгіленген антиденені қосады, ары қарай антигенге
реакцияның барлық қалған этаптарын жүргізеді. Спецификалық
комплекстің эффективтілігінің түзілуі анализдің әр деңгейінде
антиген –антидене реакциясын байланыстыратын константаға
байланысты.

17. Конкурентті ИФА

Анализдің бұл варианты конъюгат және
зерттелетін антидененің қатты фазада
Антигенді анықтау үшінсол нұсқа
адсорбирленген антигенмен байланысы
қолданылады,бірақ бұл жағдайда қалған
үшін бәсекелестігі.
антиген стандартты антигенмен антидене
Қатты фазаға байланысқан ферменттің байланысы үшін бәсекелеседі.
саны қосындыда бос антидене болуына
байланысты пропорциональды төмендейді..

18. Ингибиторлы ИФА

ИФА-ның бұл нұсқасында зерттелеетін үлгіде болатын
антиген фертментті белгімен белгіленетін моноклональды
антиденелермен байланысады және иммобилизирленген
қатты фазада олардың стандартты антигенімен әсерін
ингибирлейді.
2. Конъюгатқа спецификалы антигеннің үлгіде аз бөлігінің
болуының өзі белгіленген антидененің иммобилизирленген
антигенмен байланысын ингибирлейді.
3. Ингибирлену деңгейі ерітінді құрамындағы антигенге
тікелей пропорциональды.Сан анализін жасау үшін
калибрленген қисық сызықты құрады.
1.

19. Иммуноферментті дақ әдісі

1
2
4
5
• Пайда болған дақтарды микроскоп арқылы санайды, бұр
секретирлеуші клеткалардың саны болады
• Қатты фаза ретінде нитрацелюлозды мембрананы қолдануға болады.
НЦМ –ның жоғарғы адсорбционды қабілеттілігі антигеннің ең аз
мөлшерін қажет етеді.
• Секретирлеуші клеткалардың санын параллельді анықтау үшін және лункадағы
антигеннің немесе антидененің жалпы секретирлеуші санын анықтау үшін, басқа
субстратты қолданған кезде бірлік клеткамен секртетирлеуші заттың санын
анықтауға болады.
• Бұл әдіс клеткалар санын, секретирлеуші антигенді
бағалауға қолданылады.

20. Нәтижені есептеу

Реакция тоқтаған соң арнайы құралдардың көмегімен
лункаларға фотометрлеу жүргізіледі.
Нәтижені есептеу үшін арнайы құрылғы қолданады.
Бақылау сынамаларының оптикалық тығыздығын
салыстыру үшін анализ нәтижесіне математикалық
есеп жүргізіледі.
Ұяшықтағы оптикалық тығыздық артқан сайын
,сынамады спецификалық антидене саны арта түседі.

21.

22. ИФА-ның тәжірибеде қолданылуы

• Инфекциялық аурулап диагностикасы үшін (әртүрлі
спецификалық антигендер немесе антиденелердіанықтау үшін);
• Биологиялық үлгілерден гормондарды және дәрілік препараттарды
анықтау;
• Антигене қарсы антидене изотиптерін анықтау;
• Иммунды комплекстерді анықтау;
• Онкомаркерлерді анықтау;
• Қан сарысуынан белокты анықтау (ферритин, фибронектин);
• Жалпы IgE және спецификалық IgE антиденелерін анықтау;
• Моноклональды антиденелер скринингі;
• Биологиялық сұйықтықтан цитокиндерді анықтау.

23. ИФА көмегімен анықталатын инфекциялар.

Сифилис
диагностикасы үшін қолданылады (басқа
реакциялармен
бірге),
ВИЧ-инфекциясы,
вирусты
гепатиттер.
Хламидия
инфекциясының
диагностикасы
үшін
,
цитомегаловирусты инфекция және басқа герпестік
инфекциялар.
Қанда антидене деңгейін анықтау біріншілік жыныс
жолдарымен берілетін инфекция диагностикасы үшін қажет
емес.
ИФА нәтижесі бойынша микропреципитация реакциясымен
бірге сифилисты таниды.

24. Қорытынды

ИФА
басқа әдістермен салыстырғанда антиген және
антидене детекциясы мына қасиеттерге ие. 0,05 нг/мл
концентрацияны анықтау үшін жоғары сезімталдыққа ие.
Зерттелетін заттардың минимальды көлемін қолдануға
болады. ИФА-ны жүргізу үшін керекті ингридиенттерді
сақтауда тұрақты. Реакцияны жүргізу ыңғайлы. Реакцияның
барлық этаптарының автоматизациясы. Диагностикалық
құралдардың төмен бағада болуы. Өзінің жоғары емес
бағасына байланысты және экологиялық қауіпсіздігіне
байланысты ИФА барлық «рутинді» анализдерді артқа
қалдырды.

25. Пайдаланылған әдебиеттер

1. Самойликов П.В. Принципы иммуноферментного анализа, основные
виды ИФА, применение в диагностике интерн кафедры «Клинической
лабораторной диагностики» Российский государственный медицинский
университет 2009
2. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики
инфекционных заболеваний в клинической практике. Медицинское
информационное агентство, 2009 г.
3. Кондратьева И.А. Практикум по иммунологии. Учебное пособие для
ВУЗов. Академия,2004 г.