Биотехнология и растениеводство: получение гаплоидов, отдаленных гибридов, трансгенных растений, клональное микроразмножение

1.

2. ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ
Раздел 3. Биотехнология в народном
хозяйстве
Тема 1. Биотехнология и растениеводство:
получение гаплоидов, отдаленных гибридов,
трансгенных
растений,
клональное
микроразмножение. Культура клеточных
тканей,
протопластов,
эмбриокультура,
вторичные метаболиты их классификация.
Технология
получения
вторичных
метаболитов из культуры различных клеток.

2.

Основные методы биотехнологии,
применяемые в растениевродстве:
- генетическая трансформация (трансгеноз);
- андрогенез (культура микроспор и пыльников);
- гиногенез (культура семяпочек);
- эмбриогенез,
- культура протопластов;
- получение цибридов;
- клеточная селекция;
- ин витро размножение (культура апикальных и прочих
меристем, эмбриоидогенез (искусственные семена));
- ин витро сохранение;
- идентификация и паспортизация генотипов.

3. Методы переноса чужеродной генетической информации

С использованием
биологических
конструкций
агробактериальная
трансформация;
агролистик;
векторы на основе
вирусов.
Без использования
биологических
конструкций
баллистическая
трансформация;
введение чужеродной
ДНК в протопласты;
микроинъекции ДНК;
перенос чужеродных
генов с помощью
пыльцы;
вакуумная инфильтрация
незрелых соцветий.

4.

Наиболее широко используемый
метод трансформации –
агробактериальный,
который был разработан на основе
природного процесса.
Агробактерии
Почвенная бактерия
Agrobacterium tumefaciens
способна инфицировать
двудольные растения,
вызывая опухоли –
корончатые галлы,
при этом происходит перенос
и встраивание в растительный
геном чужеродных генов
–
почвенные бактерии, природные
генные инженеры.
Умеют встраивать свои
гены в геном двудольных растений.
Эти гены расположены
в определенной области
Ti-плазмиды агробактерий,
которая переносится
в геном растений.
Ученые «обманывают» бактерию,
заменяя часть ее генов на те,
которые хотят ввести в
растение

5.

6.

7.

8.

На 2014 г. генномодифицированные культуры
возделываются в 28 странах мира (в которых проживает
более 66% населения) на площади 184 млн. га.
Source: Clive James

9.

Страны, возделывающие трансгенные культуры

10.

В РФ в кормах и продуктах
питания присутствуют
производные около 40 ГМ
сортов сельхоз культур.

11.

СОЯ:
КУКУРУЗА, линии:
• устойчивая к
глифосату (40-3-2)
- MON810, устойчивая к кукурузному бурильщику
Ostrinia nubilatis («Monsanto Co», США)
- GA21, устойчивая к глифосату («Monsanto Co»,
США)
- NK-603, устойчивая к глифосату («Monsanto Co»,
США)
- Т-25, устойчивая к глюфосинату аммония («Bayer
Crop Science GmbH», ФРГ)
- MON863, устойчивая к жуку Diabrotica spp.
(«Monsanto Co», США)
• устойчивая к
глюфосинату аммония
(А 2704-12 и А 5547127)
КАРТОФЕЛЬ:
устойчивый к
колорадскому жуку
Рассет Бурбанк Ньюлив
Супериор Ньюлив
Елизавета 2904/1 kgs
- Bt-11, устойчивая к глюфосинату аммония и
кукурузному бурильщику Ostrinia nubilatis
(«Сингента Сидс С.А.», Франция)
Сахарная свекла:
РИС:
устойчивая к глифосату
Линия 77
устойчивый
к глюфосинату аммония

12.

В РФ ГМР пока не производятся, основные
причины:
1) недостаток информации об их
экологической безопасности,
2) отсутствие общегосударственной
научной стратегии, регламентирующей
создание, оборот и безопасное
производство ГМР (своеобразных «правил
движения»).

13. Соя

Устойчивая к глифосату – линия 40-3-3
к глюфосинату аммония – линия A 2704-12, А 5547-127

14. Кукуруза, сарарная свекла, рис, картофель (устойчивый к колорадскому жуку)

15. Соевый белок содержат

16.

Лецитины (Lecithins) – жироподобные органические
вещества в растениях и животных (принадлежат к
фосфатидам)

17.

ГМР представляют несомненный интерес
и для фармакологии, лесного
хозяйства, зеленого строительства,
ландшафтной экологии, декоративного
цветоводства и как перспективный,
возобновляемый источник
биотоплива.
17

18. Технические культуры

• лен
• конопля
• рапс
• подсолнечник
• сахарная свекла
• древесные породы

19.

Основными преимуществами такой технологии по сравнению с
традиционной селекцией являются:
- возможность переноса всего одного гена, что практически не
затрагивает исходный генотип;
- возможность придания растениям признаков, которые нельзя
перенести путем скрещивания с близкородственными видами;
- значительное ускорение процесса получения новых
генотипов

20. Основные направления в создании трансгенных растений

1.
Повышение урожайности сельскохозяйственных
культур
1.1. Создание сортов с/х культур, устойчивых к вредителям (насекомым,
грибам, бактериям, вирусам, нематодам);
1.2. Создание сортов с/х культур, устойчивых к абиотическим факторам
(засуха, засоленность, оксидативный стресс);
1.3. Создание сортов с/х культур, устойчивых к гербицидам
2. Создание сортов сельскохозяйственных культур с
улучшенной пищевой ценностью
2.1. Создание сортов с/х культур, продуцирующих биологически активные
вещества и лекарственные препараты (вакцины, витамины и др.)

21. Основные направления селекции трансгенных сортов овощных культур

Овощные культуры
Устойчивость к гербицидам
Устойчивость
к вирусам
Устойчивость к насекомым
Устойчивость к ф/п грибам
и бактериям
Устойчивость к
повышенной лежкости
Введенный ген
bar, prf
томат, капуста б/к, перец,
морковь, спаржа, салат, горох
томат, кабачок, огурец, дыня,
перец, салат, горох, фасоль
CP, CMV coat protein
CMV satellite RNA
CryIA©, CryIC
капуста белокочанная, баклажан CryIIIB, CryIIIA, CryIAb
томат, капуста белокочанная
капуста белокочанная, томат, перец,
дыня
PR-5, Tobacco Chitinase
+β-1,3 Glucanase; Cf9
Tomato chitinase, PGIP
АСО

22.

Основные достижения в области ГМ растений, достигнутые
российскими учеными
Трансгенные хризантемы
с генами эндотоксина,
RolC и халконсинтазы.
(испыт. в теплице, Голландия)
Гербицидоустойчивые клоновые подвои
яблони и груши.
(полевые испытания)
Земляника с измененным вкусом и
повышенной устойчивостью к серой гнили
(ген тауматина).
(полевые испытания)
Методика трансформации и устойчивая к
гербицидам пшеница (полевые испытания)
control

23.

Основные достижения в области ГМ растений, достигнутые
российскими учеными
Морковь устойчивая к
гербицидам и фитопатогенам
(фузариоз, антракноз - ген thauII)
(полевые испытания с 2005г.)
Томаты с пролонгированным сроком
хранения
(выключение синтеза этилена методом РНК
интерференции)
(в теплице с 2006г.)
Трансформация косточковых,
слива с генами устойчивости к гербицидам
и вирусу Шарки
(на основе РНК интерференции )
Методика позитивной селекции
(трансгенные растения без генов устойчивости к антибиотикам и
гербицидам, слива с геном фосфоманнозизомеразы)

24.

Министр экологии Великобритании Паттерсон
заявил: «Задача биотехнологии в сельском хозяйстве
– способствовать повышению урожайности
сельхозкультур и устойчивости к болезням и
вредителям. Проблему ГМО необходимо
рассматривать в контексте сопутствующих рисков и
выгод. Не надо бояться говорить общественности о
выгодах ГМО для массового питания, о значительном
сокращении использования пестицидов, а также
дизельного топлива»
Январь 2013 г.
«Пищевые продукты, содержащие ГМО и
продаваемые на мировом рынке, вредного
воздействия на здоровье людей не оказали…»
(из заключения Всемирной Организации Здравоохранения-ВОЗ)

25. Действие Bt-ГМР (in situ и ex situ) на почвенное население

Геобионты
(число корректных опытов)
НЕТ
ЭФФЕКТА
+ –
1. ЗЕМЛЯНЫЕ ЧЕРВИ (6)
6
-
-
2. МОКРИЦЫ (4)
3
-
1
3. МНОГОНОЖКИ (1)
1
-
-
4. КОЛЛЕМБОЛЫ, КЛЕЩИ (9)
8
-
1
5. НЕМАТОДЫ (12)
7
1
4
6. ПРОТОЗОА, МИКРООРГАНИЗМЫ (22)
13
3
6
…………………………………………………………… ……………. ….. ……..
ИТОГО (54) :
38
4
12

26. Оценка хронической токсичности энтомотоксина Cry1Ab на аутбредных мышах

На мышах линии CD-1 изучена хроническая
токсичность альтернативного материала,
содержащего фитомассу кукурузы и
инсектицидный белок Cry1Ab, наработанный
штаммом ВКПМ В-1226 (Bac. thuringiensis subsp.
kurstaki H3a3b).
В течение 30 дней мышам опытных групп
скармливали ad libitum традиционный корм +
альтернативный материал (Cry1Ab 10 мг/кг), в
восстановительном периоде -14 дней – только
традиционный корм. Животные контрольных групп
в течение всего эксперимента получали ad libitum
только традиционный корм.

27.

По итогам опыта оценивали:
(после 30-дневного курса скармливания и 14дневного восстановительного периода)
• общее состояние животных,
• гематологический анализ периферической
крови,
• биохимический анализ сыворотки крови,
• патоморфологические изменения
Вывод: достоверных изменений у
подопытных животных, вызванных
действием Cry1Ab-белка, не выявлено.

28.

Получение гаплоидов
Способы получения:
- культура микроспор и пыльников);
- культура семяпочек;
- культура незрелых зародышей.
ГАПЛОИД – ядро, клетка, организм, характеризующиеся одинарным набором хромосом,
представляющим половину полного набора, свойственного виду.

29.

Культуры клеток растений представляют собой гетерогенные
популяции, при клонировании которых можно выделить индивидуальные
линии со своими характеристиками, включая интенсивность роста и
биосинтеза вторичных метаболитов, причем клоны могут различаться по
этим признакам в десятки раз.
В результате использования спонтанного и индуцированного
мутагенеза и селективных систем был выделен ряд перспективных
клеточных клонов и штаммов-продуцентов БАВ, причем стабильность их
сохраняется на протяжении многих лет.
Факторами, влияющими на рост клеток и их продуктивность по
вторичным метаболитам, являются компоненты среды выращивания, прежде
всего качественный и количественный состав фитогормонов, углеводов,
ряда минеральных солей, рН среды, температура выращивания, степень
аэрации, способ и интенсивность перемешивания, условия освещения. По
значению для продуктивности культур факторы можно выстроить в
следующий ряд: минеральный состав среды, количество и соотношение
фитогормонов, соотношение нитратного и аммонийного азота, качественный
и количественный состав углеводов, степень аэрации культуры.

30. Вторичные метаболиты

31.

Вторичные метаболиты - соединения, часто
сложного состава, не являющиеся основными
промежуточными соединениями метаболизма клетки,
образуются в его тупиковых ветвях. К вторичным
метаболитам растений можно отнести, например,
алкалоиды.
Микроорганизмы
образуют
вторичные
метаболиты, как правило, в период замедления или
прекращения активного роста и размножения культур. В
качестве вторичных метаболитов микроорганизмы
образуют некоторые пигменты, антибиотики, витамины.

32. Четыре признака вторичных метаболитов:

присутствие не во всех растениях;
наличие биологической активности;
относительно низкая молекулярная масса;
небольшой набор исходных соединений для их
синтеза.

33. Основные группы вторичных метаболитов

Хорошо известны три самые большие группы
вторичных метаболитов - алкалоиды, изопреноиды
(терпеноиды) и фенольные соединения. Каждая из
этих групп состоит из несколько тысяч соединений и
подразделяется
на
многочисленные
подгруппы.
Известно
также
около
десятка
менее
многочисленных
групп
вторичных
метаболитов:
растительные амины, небелковые аминокислоты,
цианогенные
гликозиды,
глюкозинолаты,
полиацетилены, беталаины, алкиламиды, тиофены
и др. Количество соединений, входящих в эти группы,
колеблется от единиц до нескольких сотен.

34.

• Вторичные метаболиты в растении практически никогда
не присутствуют в «чистом виде», они, как правило,
входят в состав сложных смесей. Такие смеси в
зависимости от их состава и нахождения в растении часто
носят собственные, исторически сложившиеся названия.
• Эфирные масла, как правило, представляют из себя смесь
легко
испаряющихся
изопреноидов
(монои
сесквитерпенов).
• Смолы представлены главным образом дитерпенами.
• Камеди состоят преимущественно из полисахаридов, но в
их состав часто входят алкалоиды, фенольные соединения.
• Слизи - это смесь водорастворимых олиго- и
полисахаридов, Сахаров, а также небольших количеств
фенольных соединений, алкалоидов или изопреноидов

35. Фенольные соединения

Встречаются у всех растений, но они различны у растений разных видов. Известно
8 000 фенолов.
Представители: антоцианы, таннины, фитоалексины, лигнин, кофейная, коричная кислоты,
кумарин.
Фенолы находятся в вакуолях, пластидах, в лепестках цветков, в плодах, в клеточных
стенках.
Функции фенолов:
участвуют в транспорте электронов при фотосинтезе и дыхании (пластохинон,
убихинон),
влияют на окраску растений (антоцианы в листьях, корнеплодах, цветках);
привлекают насекомых и птиц, опыляющих цветки или переносящих семена;
влияют на дифференцировку клеток,
на образование в клетках гормонов (этилена, подавляют синтез ИУК);
тормозят ризогенез и растяжение клеток;
являются фитотоксинами (оказывают антимикробное действие);
с их помощью одно растение может действовать на другое,
дубильные вещества повышают устойчивость деревьев к грибным поражениям.
Используются в медицине для стерилизации, лекарства (салициловая кислота), в
промышленности как красители.

36. Алкалоиды

Гетероциклические соединения, содержащие в молекуле
один или несколько атомов азота.
Известно около 10 000 алкалоидов. Они найдены у 20%
растений, наиболее распространены среди цветковых растений.
Представители: никотин, анабазин, эфедрин, морфин.
Они накапливаются в активно растущих тканях, в клетках
эпидермы и гиподермы, в обкладках проводящих пучков, в
млечниках. Могут накапливаться не в тех клетках, где
образуются. Алкалоиды находятся в листьях, коре, корнях,
древесине.
Разные растения могут содержать различные
алкалоиды.
Функции алкалоидов: регулируют рост растений (ИУК,
кофейная и коричная кислоты), защищают растения от поедания
животными. Используются алкалоиды в качестве лекарств, для
борьбы с насекомыми.

37. Изопреноиды (терпеноиды)

Соединения, составленные из нескольких изопреновых единиц (С5Н8 –
изопрен) и имеющие общую формулу (С5Н8)n. Благодаря
дополнительным группам (радикалам) изопреноиды могут иметь число
атомов углерода в молекуле некратное 5. К терпенам относятся не только
углеводороды, но и соединения со спиртовыми, альдегидными, кето-,
лактон- и кислотными группами. Политерпены – каучук, гутта.
Представители: гибберелловая, абсцизовая кислоты, цитокинины,
каротиноиды.
Находятся в хлоропластах, в мембранах; входят в состав масла хвои,
шишек, цветков, плодов, древесины; смол, латекса, эфирных масел.
Функции:
• - защищают растения от бактерий, насекомых, животных;
• - являются гормонами (цитокинины, гиббереллины, абсцизовая
кислота, брассиностероиды);
• - каротиноиды участвуют в световой фазе фотосинтеза, защищают
хлорофилл от фотоокисления;
• - стеролы входят в состав мембран, влияют на их проницаемость.
Используют в медицине как лекарства (камфора, ментол,
сердечные гликозиды витамин А), в парфюмерии.

38. Особенности синтеза вторичных метаболитов:

1) предшественниками для их синтеза служит небольшое
количество первичных метаболитов;
2) многие вторичные метаболиты синтезируются разными
путями;
3) в синтезе участвуют специальные ферменты.
Синтезируются в цитозоле (цитозо́ль — жидкое содержимое клетки.
Большую часть цитозоля занимает внутриклеточная жидкость. Цитозоль
разбивается на составляющие при помощи разнообразных мембран),
эндоплазматическом ретикулуме, хлоропластах

39. Локализация вторичных метаболитов

Накапливаются в вакуолях (алкалоиды, фенолы, беталаины,
цианогенные
гликозиды,
глюкозинолаты),
в
периплазматическом
пространстве (фенолы). Изопреноиды после синтеза выходят из клетки.
Вторичные метаболиты редко распространены в тканях равномерно.
Часто они накапливаются в идиобластах (идиобла́сты — отдельные
растительные клетки, резко отличающиеся от окружающих клеток по форме и
величине. Идиобласты могут встречаться в любой ткани или системе тканей),
млечниках, специальных каналах и ходах.
Места синтеза и локализации часто разделены.
Вторичные метаболиты выделяются во внешнюю среду с помощью
выделительных тканей (железистых клеток, железистых волосков – трихом).
Для алкалоидов выделение нехарактерно.
Синтез и накопление в тканях вторичных метаболитов зависит
главным образом от вида растения, иногда от этапа онтогенеза или возраста,
от внешних условий. Распределение в тканях зависит от вида растения.

40. Тканевая локализация вторичных метаболитов

А. Сканирующая электронная
микрофотография
поверхности листа тимьяна.
Круглые структуры пельтатные железистые
волоски (трихомы), в которых
синтезируются моно- и
сесквитерпены.
B Световая микрофотография
железистого волоска мяты,
показанного в продольном
сечении. C – субкутикулярное
пространство; S, секреторные
клетки; St - ножка; B,
базальная клетка; E,
эпидермальная клетка.
C. Световая микрофотография
секреторной полости в листе
лимона, показанной в
поперечном сечении. L,
люмен; Sh, клетки футляра; P,
клетки паренхимы.
D. Световая микрофотография
смоляного хода в древесине
сосны Джеффра, показанной в
поперечном сечении X,
вторичная ксилема.

41. Главные функции вторичных метаболитов:

- участие в фотосинтезе,
- запасающая (азот),
защищают от биопатогенов, животных,
регулируют рост, движения.
- обеспечивают окраску цветков и плодов,
- способствуют размножению растений и
распространению семян,
- сдерживают прорастание семян конкурирующих
видов.

42. Растения как источник биологически активных веществ (БАВ)

При производстве более 25% современных лекарств используется
растительное сырье. Растения являются продуцентами многих БАВ –
соединений, способных оказывать влияние на биологические процессы в
организме. К таким соединениям принадлежат сердечные гликозиды,
сапонины, стерины, каратиноиды, полифенолы, алкалоиды, витамины,
хиноны, а также вещества, обладающие специфическим ароматом, вкусом и
окраской.
Биологически активные вещества принадлежат к продуктам
вторичного обмена, которые называют вторичными метаболитами или
вторичными продуктами биосинтеза. В настоящее время известно более 100
000 вторичных метаболитов, продуцируемых растениями. Многие из них
являются практически, экономически важными продуктами и используются в
фармакологической, косметической, пищевой промышленности.

43. Преимущества использования культур клеток растений для производства БАВ являются:

• сохранение природных ресурсов;
• высокая скорость получения биомассы (женьшень
корень – 1 г в год, культура клеток – 2 г/л/сут);
• управляемость процесса;
• независимость от сезона;
• экологическая чистота;
• для штаммов-суперпродуцентов более высокое
содержание продукта

44. Этапы получения штаммов-продуцентов:

выбор объекта;
выбор экспланта;
получение каллусной культуры;
анализ наличия продукта;
получение суспензии;
анализ наличия и количества продукта;
оценка рентабельности;
получение активно растущих и синтезирующих клонов;
оптимизация условий выращивания;
выбор метода выделения продукта;
применение элиситоров — веществ с низким молекулярным весом, выделяющихся из
Иммобилизация ();
масштабирование.
клеточных стенок патогенных организмов (напр., грибов) или из разрушающихся стенок
растительных клеток. Способны индуцировать активность генов, кодирующих ферменты
фенилпропаноидного пути. Действие этих ферментов ведет к аккумуляции т. н. фитоалексинов и
фенольных соединений с фунгицидными свойствами;

45.

Открытие элиситоров – сигнальных молекул,
запускающих ответ растительного организма на атаку
патогенов – стало ключевым моментом в повышении
продуктивности культур клеток. Установлено, что некоторые
экзометаболиты грибов, фрагменты их клеточных стенок, ряд
микробных токсинов, различные тяжелые металлы, а также
УФ облучение и ультразвук способны увеличивать синтез и
накопление вторичных метаболитов в растениях. В качестве
мощных элиситоров могут выступать жасмоновая кислота и
ее производные. К настоящему моменту известно множество
примеров интенсификации синтеза вторичных метаболитов в
культурах клеток растений под действием жасмонатов. В
последнее время в качестве еще одного мощного элиситора
рассматривается фитотоксин коронатин.

46.

Для крупномасштабного культивирования
растительных
клеток
для
препаративного
получения
вещества
вторичного
синтеза
используют специальные металлические и
стеклянные
ферментаторы
(биореакторы)
различной конструкции (с мешалкой или
барботажного
типа).
Режим
ферментации
периодический
(накопительный)
или
непрерывный, главным образом хемостатный.
Биосинтез продуктов вторичного синтеза
проводят в ферментерах объемом от 0,1 до 63 м3 и
более.
Аэрацию
культуральной
биомассы
осуществляют стерильным воздухом через
барботер. Воздух стерилизуют, как правило,
путем фильтрации на двух-трех последовательно
установленных
фильтратах.
В
ходе
культивирования клеток растений регулируют
температуру (25-37°С), рН и окислительновосстановительные потенциал.

47. Методы иммобилизации клеток делят на 4 категории:

Иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном субстрате.
Например, клетки Catharanthus roseus, Digitalis lanata в альгинатных, агарозных
шариках, в желатине и т.д. Метод предполагает обволакивание клеток одной из
различных цементирующих сред – альгинат, агар, коллаген, полиакриламид.
Адсорбция клеток на инертном субстрате. Клетки прилипают к заряженным
шарикам из альгината, полистирола, полиакриламида. Метод применялся в
экспериментах с животными клетками, а также клетками Saccharomyces uvarum, S.
cerevisiae, Candida tropicalis, E. coli.
Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических
макромолекул (таких, как лектин). Применяется редко, есть сведения об экспериментах
с различными линиями клеток человека, эритроцитами крови барана,
адсорбированными на покрытой белком агарозе.
Ковалентное связывание с другим инертным носителем типа КМЦ. Очень
редко применяется, известная удачная иммобилизация для Micrococcus luteus. В
основном проводились эксперименты по иммобилизации клеток животных и
микроорганизмов.

48. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ:

1. Клетки, иммобилизованные в или на инертном субстрате,
образуют биомассу гораздо медленнее, чем растущие в
жидких суспензионных культурах.
2. Кроме медленного роста иммобилизация клеток позволяет им
расти в тесном физическом контакте друг другом, что
благоприятно отражается и на химических контактах.