Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия

1. Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия

2. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ  — метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов,

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ — метод микроскопии, позволяющий
наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов,
клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав

3.

Первичная
люминесценция
• Ароматические
аминокислоты,
порфирины,
хлорофилл, витамины
(А, В2, В1),
антибиотики,
химиотерапевтические
вещества
Вторичная
(наведенная)
люминесценция
• Обработка объектов
флюоресцирующими
красителями флюорохромами

4. Отличия от светового микроскопа:

• Мощный источник
света в осветителе
(ртутно-кварцевая
лампа, галогенная
кварцевая лампа);
• Система
светофильтров:
Возбуждающие
светофильтры,
Теплозащитные
светофильтры,
«Запирающие»
светофильтры.

5.

Флуоресцентная метка
• Исследования ДНК и РНК, с помощью флуоресцентных
протеиновых маркеров
Флуоресцентный зонд
• А – флуоресценция растет,
• В – флуоресценция угасает,
• С – изменение цвета одного из параметров

6.  Горизонтальные линии — энергетические уровни электронов: S0 — основное, невозбужденное состояние; S1 — синглетное возбужденное

Диаграмма Яблонского.
Горизонтальные линии — энергетические уровни электронов: S0 — основное,
невозбужденное состояние; S1 — синглетное возбужденное состояние; 0 — 3 —
квантованные подуровни; Т1, Т2 — квантованные уровни триплетного
возбужденного состояния. Стрелками показаны переходы электронов в разные
энергетические состояния

7. Спектры поглощения и флуоресценции 

Спектры поглощения и флуоресценции
Спектры поглощения (пунктир) и
флуоресценции (сплошные линии)
флуоресцеина и вещества с
коммерческим названием Lyso
TrackerTM Blue
Спектры флуоресценции Lyso
SensorTMYellow/Blue при рН 3 и 9. При
изменении кислотности среды
меняются и максимум флуоресценции,
и общая форма спектра.

8. Квантовый выход флуоресценции

Количественно определяется как отношение числа высвеченных
фотонов к числу поглощенных. Чем больше квантовый выход, тем
больше интенсивность свечения флуорофора.

9. Время жизни флуоресценции

Это величина порядка наносекунд для большинства флюорофоров. Она показывает
усреднённое время существования молекулы в возбуждённом состоянии. Если построить
график затухания флуоресценции во времени, он будет иметь вид экспоненциальной
кривой. В простейшем случае падение будет моноэкспоненцальным, то есть будет иметь
вид прямой в логарифмических координатах.

10. Анизотропия флуоресценции

Показывает, насколько свободно вращается
молекула за время существования возбуждённого
состояния. Свободные флюорофоры в жидких
растворителях при нормальных условиях
вращаются быстро, что вызывает полную
деполяризацию. Если флюорофор связан с
большой биомолекулой, например с белковой
глобулой, такой комплекс вращается в
пространстве медленнее, что приводит к
ненулевым значениям анизотропии.

11. Тушение флуоресценции

F0/F - отношение начальной флуоресценции к флуоресценции в присутствии
гасителя

12. Фёрстеровский резонансный перенос энергии (ФРПЭ)

Важным является что ФРПЭ происходит на
расстояниях, соизмеримых с размерами
биологических объектов, таких как белковые
глобулы или мембраны клеток. При этом
относительная эффективность переноса энергии
обратно зависит от расстояния между ФРПЭпартнёрами.

13.

Органические флуорофоры

14. Трёхмерная структура молекулы зелёного флуоресцентного белка и структурная формула его флуорофора

15. Неорганические флуорофоры

Относительные размеры флуоресцентных репортеров. Для сравнения показан белок
иммуноглобулин G (Ig G)

16. Методы флуоресцентной окраски клеток.

• Низкомолекулярные органические флуоресцентные
красители для клеточных органелл (Нил красный –
мембраны, липосомы, цвет флуоресценции красный;
Hoechst 33342 – ядерная ДНК, цвет - синий).
• Иммунофлуоресцентная покраска. Этот метод
базируется на использовании антител.
• Автофлуоресцентные белки. Созданные на
базе зелёного флуоресцентного белка и его аналогов,
являются незаменимыми флуоресцентными
маркерами клеточной и молекулярной биологии.

17.

Фибробласты мыши
Митоз в клетках легких тритона
Веслоногий рачок Temora longicornis
Клетки глии мозжечка мыши