Клонирование и очистка рекомбинантного белка

1. Практикум в лаборатории нанобиотехнологии

ПРАКТИКУМ В
ЛАБОРАТОРИИ
НАНОБИОТЕХНОЛОГИ
И
Прянишникова Т. В.
Слободина А.С.
Группа 33417/1
Подгруппа 3

2. Клонирование и очистка рекомбинантного белка

КЛОНИРОВАНИЕ И
ОЧИСТКА
РЕКОМБИНАНТНО
ГО БЕЛКА
ДАНО: последовательность
нуклеиновой кислоты (ДНК)
Ожидаемый
результат:
RFP mCherry

3. Используемые методы

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ МЕТОДЫ
ПЦР
Электрофорез в агарозном геле
Полиакриламидный гель-электрофорез в денатурирующих
условиях

4. Первый шаг: проведение пцр

ПЕРВЫЙ ШАГ:
ПЦР
ПРОВЕДЕНИЕ
Реагент
пропорции
Buffer
10 μl
DNA template
0,1 μl
Primer 1
5 μl
Primer 2
5 μl
dNTPs
2 μl
Taqpol
4 μl
H2O
73,9 μl
Итог: V=100 μl

5. Второй шаг: проведение электрофореза

ВТОРОЙ ШАГ:
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
1% раствор агарозы
Для утяжеления пробы
добавили краску с
глицерином
ПРОВЕДЕНИЕ

6. Третий Шаг: определение концентрации фрагмента дНк

ТРЕТИЙ ШАГ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ
КОНЦЕНТРАЦИИ ФРАГМЕНТА ДНК

7. четвертый Шаг: Реакция рестрикции

ЧЕТВЕРТЫЙ ШАГ:
РЕСТРИКЦИИ
РЕАКЦИЯ
Наименование
С амплификатом
Плазмида
Buffer R
2 μl
2 μl
NdeI
0,7μl
0,7 μl
XhoI
0,5 μl
0,5 μl
Plasmide
10 μl
-
Amplificate
-
4,08 μl
H2O
6,8 μl
12,72 μl
Итог: V=20 μl

8. Пятый Шаг: определение концентраций порезанной плазмиды и порезанного ПЦР продукта

ПЯТЫЙ ШАГ:
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
КОНЦЕНТРАЦИЙ ПОРЕЗАННОЙ ПЛАЗМИДЫ И
ПОРЕЗАННОГО ПЦР ПРОДУКТА
Для плазмиды концентрация
равна 107,8 нг/мкл.
Для фрагмента ДНК
концентрация равна 115,1
нг/мкл.

9. шестой шаг: реакция лигирования

ШЕСТОЙ ШАГ:
ЛИГИРОВАНИЯ
РЕАКЦИЯ
Наименование
пропорции
Buffer x10
2 μl
Amplificate
0,62 μl
Plasmide
1,86 μl
T4-ligase
1 μl
H2O
15,14(for amp); 13,9 μl (for plasmide)
Итог: получили две пробирке, объем каждой из которых равен
V=20 μl

10. Седьмой шаг: проведение электрофореза

СЕДЬМОЙ ШАГ:
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Маркер
Плазмида pet21a
Плазмида
pet21a/res
Amplificate/res
ПРОВЕДЕНИЕ

11. Восьмой шаг: трансформация бактерий

ВОСЬМОЙ ШАГ:
ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИЙ
Клетки подвергаем тепловому шоку
(420С , 1 мин)
Опускаем в лед (2 мин)
Растим в дневной культуре (LB, 370С ,
1час)
Рассеиваем на чашках Петри

12. Девятый шаг: изъятие клеток

ДЕВЯТЫЙ ШАГ:
КЛЕТОК
ИЗЪЯТИЕ
Сковырнуть носиком полклона
С обратной стороны подписать
номер
В пробирку с 20 μl воды опускаем
носик с клоном и крутим на
вортексе
Собрали 10 клонов с чашки с
ампициллином и 3 с контрольной
чашки

13. Десятый шаг: проведение Пцр

ДЕСЯТЫЙ ШАГ:
ПЦР
ПРОВЕДЕНИЕ
Наименования
На 15 пробирок
Buffer 10x
15 μl
Primer 1
7,5 μl
Primer 2
7,5 μl
dNTPs 50x
3 μl
Taq pol
4,5 μl
H2O
105 μl
Сначала в каждую пробирку разливаем клетки по 0,5 μl, затем
добавляем из микса по 9,5 μl. В итоге получаем 15 пробирок по 10
μl.

14. Одиннадцатый шаг: Электрофорез

ОДИННАДЦАТЫЙ ШАГ:
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Получили два
удачных клона: 6 и 9

15. Двенадцатый шаг: трансформация штамма rosetta

ДВЕНАДЦАТЫЙ ШАГ:
ТРАНСФОРМАЦИЯ ШТАММА ROSETTA
Добавить плазмиду (1 μl) к клеткам; помешать
носиком
Оставить пробирку на льду 30 мин
Подвергнуть клетки тепловому шоку (420С) в
течение 1 минуты
Оставить пробирку на льду на 2 минуты
Добавить в пробирку 400 μl жидкой среды LB
(ночной) и инкубировать пробирку при 370С
500rpm 4 час
Втереть 200 μl клеток в чашки Петри с плотной
средой LB
В результате получили 0,56 г осадка клеток

16. Тринадцатый шаг: Разрушение клетки

ТРИНАДЦАТЫЙ ШАГ:
РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТКИ
Buffer
NaH2PO4
50mM
NaCl
300 mM
Imidazole
5 mM
разрушение
ультрозвуком
химически

17. Четырнадцатый шаг: лизирование клеток

ЧЕТЫРНАДЦАТЫЙ ШАГ:
ЛИЗИРОВАНИЕ КЛЕТОК
На 1 г клеток берем: 5 ml Imidazole
50 μl лизоцима
Держим 20 минут на льду (жидкость становится вязкой)
Воздействуем соникатом (вязкость исчезает)
Центрифугируем 20 минут 15000g 40C
Итог: в осадке содержатся нерастворимые белки, клеточные стенки,
остатки ДНК, но большая часть белка mCherry находиться в растворе.

18. Пятнадцатый шаг: выделение белка с помощью Ni-NTA

ПЯТНАДЦАТЫЙ ШАГ:
БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ NI-NTA
ВЫДЕЛЕНИЕ
В колонку нанести белок, но не перегрузить. Собрать пару капель
проскока
Когда колонка свяжется с белком, нанести washing buffer 30mM 4 ml.
Собрать 50 μl раствора после того, как сольем 1 ml
Элюция 200 mM Imidazole, собрать несколько фракций
Итог собрали несколько пробирок с белком в буфере 200 mM Imidazole
по 150 μl
1) Проскок
wash
3) 1-ая фракция
4) 2-ая фракция
2)

19. Шестнадцатый шаг: электрофорез в полиакриламидном геле

ШЕСТНАДЦАТЫЙ ШАГ: ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Наименование
Разделяющий 12,5%
Концентрирующий 5%
H2O
1,7 ml
1,4 ml
AA
2 ml
330 μl
Tris HCl
pH=8,8
SDS
50 μl
20 μl
10% PSA
50 μl
20 μl
TEMED
3 μl
2 μl
1,25 ml
pH=6,8
250 μl
Добавляем 5х краску
V(пробы)=4μl краски +7μl пробы +9μl воды+SDS=20 μl
Ставим в термостат на 950С на 5 минут

20. Результат Электрофореза

РЕЗУЛЬТАТ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

21. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ

22.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ