Объекты биотехнологии и их промышленное использование

1. ОБЪЕКТЫ БИОТЕХНОЛОГИИ И ИХ ПРОМЫШЛЕННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

2.

• Биотехнологические объекты находятся на
разных ступенях организации:
• а) субклеточные структуры (вирусы, плазмиды,
ДНК митохондрий и хлоропластов, ядерная
ДНК);
• б) бактерии и цианобактерии;
• в) грибы;
• г) водоросли;
• д) гетеротрофные протисты;
• е) культуры клеток растений и животных;
• ж) растения.

3.

• Биотехнологическое производство
• Выделяют 5 стадий, этапов, или операций,
биотехнологического производства.
• Две начальные стадии включают подготовку
необходимой биологически действующего начала и
сырья. При осуществлении биологического синтеза
необходимы стадии приготовления питательной
среды и поддержания чистой культуры, которая
могла бы постоянно или по мере необходимости
использоваться в процессе.
• Третья стадия - стадия ферментации, на которой
происходит образование целевого продукта. На этой
стадии идет превращение компонентов питательной
среды сначала в биомассу, затем, если это
необходимо, в целевой метаболит.

4.

• На четвертом этапе из культуральной жидкости
выделяют и очищают целевые продукты. Процессы
выделения и очистки, часто занимающие важное место
среди др. технологических операций, определяются
химической природой получаемого вещества и могут
включать экстракционные и хроматографические
методы, кристаллизацию, фильтрацию, осаждение и др.
• Заключительная стадия промышленного производства
- получение товарных форм целевых продуктов. Общим
свойством большинства продуктов биологического
синтеза является их недостаточная стойкость к
хранению, следовательно, на заключительной стадии
производства крайне важны способы стабилизации и
консервации целевых продуктов.

5.

Выбор биотехнологических объектов
Принципы подбора биотехнологических
объектов
Штамм-продуцент должен характеризоваться
следующими свойствами:
1. способностью расти в чистой культуре и
генетической стабильностью;
2. отсутствием патогенности и токсичности;
3. высокой скоростью роста при массовом
культивировании
и
способностью
синтезировать
продукт
в
большом
количестве и за короткий промежуток
времени (до 3 суток);

6.

4. устойчивостью к контаминации (например,
за счет изменения физико-химических
условий среды, способности к росту при
повышенных температурах или к синтезу
антибиотиков);
5. способности расти на простых и дешевых
питательных средах.

7.

Биотехнологическое использование
микроорганизмов
условно можно разбить на несколько основных групп:
1) получение живой или инактивированной
микробной
биомассы
(производство
пекарских, винных, кормовых дрожжей;
вакцин, белково-витаминных концентратов, средств защиты растений, заквасок
для получения кисломолочных продуктов
и силосования кормов, почвоудобрительных препаратов и т.д);

8.

2) получение продуктов метаболизма
микроорганизмов (антибиотики, гормоны,
аминокислоты, витамины, органические
кислоты и т.д.);
3)
получение
ферментов
микробного
происхождения;
4) получение рекомбинантных продуктов;
5) биотрансформация веществ;
6) утилизация неприродных соединений.

9.

• Во многих биотехнологических процессах
используется
ограниченное
число
микроорганизмов, которые классифицируются
как GRAS («generally recognized as safe») и
обычно считаются безопасными. К таким
микроорганизмам относят бактерии Bacillus
subtilis, другие виды бацилл и лактобацилл, виды
Streptomyces. Сюда также относят виды грибов
Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и
дрожжей Saccharomyces и др.
• GRAS-микроорганизмы
непатогенны
и
нетоксичны, поэтому при разработке нового
биотехнологического
процесса
следует
ориентироваться на данные микроорганизмы,
как базовые объекты биотехнологии.

10.

• Для создания новых биотехнологических
штаммов
микроорганизмов-продуцентов
можно использовать классический путь –
проводится выделение микроорганизмов из
мест, где обитание того или иного
продуцента наиболее вероятно.
• Другой путь подбора микроорганизмов – из
имеющихся коллекций микроорганизмов.
• Главным
критерием
при
отборе
продуцентов
является
способность
микроорганизмов синтезировать целевой
продукт.

11.

•Правильный
выбор
микроорганизмовпродуцентов имеет определяющее значение,
поскольку гарантирует стабильное получение
заданного целевого продукта. Наиболее часто
для этих целей используются прокариотические
микроорганизмы и дрожжевые грибы.
•В большинстве случаев для достижения целей
биотехнологического
производства
используются оптимизированные (а не
выделенные непосредственно из природных
источников
или
коллекций)
штаммы
микроорганизмов,
позволяющие
понизить
стоимость производства вследствие повышения
их продуктивности и приобретения более
специфических свойств.

12.

• К основным методам оптимизации,
используемым
в
промышленной
биотехнологии,
относят
мутагенез,
селекцию и метаболическую инженерию,
приводящую
к
изменению
ферментативных,
транспортных
и
регуляторных свойств клеток, которое
способствует
оптимизации
клеточной
активности.

13.

Схема селекции микроорганизмов

14.

• Особенностями микроорганизмов в качестве
объектов биотехнологии является то, что
обычно
они
характеризуются
более
высокими
скоростями
роста
и
биосинтетических процессов, чем высшие
организмы.
• Тем
не
менее,
существуют
такие
микроорганизмы (например, олиготрофные),
которые растут крайне медленно, однако они
представляют известный интерес, поскольку
способны продуцировать различные очень
ценные вещества.

15.

•Особый интерес как биотехнологические
объекты
вызывают
фотосинтезирующие
микроорганизмы. Они являются крайне
неприхотливыми к питательным веществам и
обходятся самыми дешевыми источниками
энергии,
углерода,
восстановительных
эквивалентов и азота (цианобактерии и
микроскопические водоросли), способны к
усвоению атмосферного азота (цианобактерии).
Фототрофные микроорганизмы перспективны
как продуценты аммиака, водорода, белка и
различных ценных органических соединений.

16.

• Однако в настоящее время пpoгpecca в их
использовании в промышленных технологиях ожидать не следует вследствие
ограниченности фундаментальных знаний
об их генетической организации и
молекулярно-биологических
механизмах
жизнедеятельности.

17.

•Другими привлекательными объектами для
биотехнологии
являются
термофильные
организмы, которые оптимально растут при
высоких температурах (60-80 °C, 110 °C и
выше), что затрудняет развитие посторонней
микробиоты. Среди термофилов существуют
ценные продуценты спиртов, аминокислот,
ферментов,
молекулярного
водорода.
Применение термофилов позволяет снизить
затраты на стерилизацию промышленного
оборудования,
а
скорость
роста
и
метаболическая активность у этих организмов
в 1,5-2 раза выше, чем у мезофилов.

18.

•Ферменты,
синтезируемые
термофилами,
характеризуются повышенной устойчивостью
к нагреванию, некоторым окислителям,
детергентам, органическим растворителям и
другим неблагоприятным факторам. В то же
время они мало активны при обычных
температурах. Так, протеазы представителей
термофильных микроорганизмов при 20 °C в
100 раз менее активны, чем при 75 °C, что
является очень важным свойством для
некоторых промышленных производств.
•Например,
широкое
применение
в
генетической инженерии нашел фермент Taqполимераза из термофильной бактерии
Thermus aquaticus.

19.

• В последние годы расширяется применение
смешанных культур микроорганизмов и их
природных
ассоциаций.
Основные
преимущества смешанных культур по
сравнению с монокультурами:
• - способность утилизировать сложные,
неоднородные по составу субстраты,
зачастую непригодные для монокультур;
• - способность к минерализации сложных
органических соединений;

20.

повышенная
способность
к
биотрансформации органических веществ;
- повышенная устойчивость к токсичным
веществам, в том числе тяжелым металлам;
- повышенная устойчивость к воздействию
окружающей среды;
- повышенная продуктивность;
возможный
обмен
генетической
информацией между отдельными видами
сообщества.
• -

21.

Бактерии и цианобактерии
Бактерии используются при производстве
пищевых продуктов (уксуса, молочнокислых
продуктов и др.); биоинсектицидов; белка;
витаминов; растворителей и органических
кислот; биогаза и фотоводорода (Halobacterium
halobium).
Уксуснокислые
бактерии,
представленные
родами
Gluconobacter
и
Acetobacter, превращают этанол в уксусную
кислоту, а уксусную кислоту в углекислый газ и
воду. Сlostridium acetobutylicum сбраживает
сахара в ацетон, этанол, изопропанол и nбутанол; другие виды могут также сбраживать
крахмал, пектин и различные азотсодержащие
соединения.

22.

Гетероферментативные молочнокислые бактерии рода Leuconostoc превращают углеводы в
молочную кислоту, этанол и углекислый газ.
Гомоферментативные молочнокислые бактерии
рода
Streptococcus
продуцируют
только
молочную кислоту, а брожение, осуществляемое
представителями рода Lactobacillus, позволяет
получить наряду с молочной кислотой ряд
разнообразных продуктов.
Corynebacterium glutamicum служит источником аминокислот. Коринебактерии используются также для микробного выщелачивания руд
и утилизации горнорудных отходов. Виды родов
Streptomyces, Bacillus и Micromonospora
продуцируют
широко
применяемые
антибиотики.

23.

Многие
бактериальные
полисахариды
обладают
выраженной
биологической
активностью,
обусловливающей
их
использование в медицине в качестве
лечебных и профилактических препаратов
(декстраны,
продигиозин
–
Serratia
marcescens, полисахариды бактерий родов
Alcaligenes, Agrobacterium и др.). Микробные
полисахариды могут быть основой для
создания искусственных вакцин после
изменения их конфигурации или путем
конъюгации
с
синтетическими
электролитами.

24.

Нейтральные декстраны с молекулярной
массой
около
75000
(Leuconostoc
mesenteroides) широко используются
в
качестве заменителей плазмы крови. В
фармацевтике полисахариды используются как
основа для лекарственных форм (разрыхлители, стабилизаторы, эмульгаторы).
•Витамин B12 получают практически только
путем микробного синтеза. Основными
продуцентами при этом служат пропионовокислые
бактерии,
используются
также
Nocardia rugosa, виды родов Micromonospora,
Pseudomonas, Clostridium, некоторые актиномицеты, а также комплекс метанобразующих
бактерий, использующих отходы бродильной
промышленности.

25.

• Некоторые
бактерии
способны
к
сверхсинтезу витамина B2 с активным
выделением его в среду, но в качестве
промышленных продуцентов используют,
главным образом, виды рода Nocardia,
некоторые актиномицеты, микобактерии.
• Штаммы рода Flavobacterium способны к
продукции зеаксантина, получаемого
только путем микробного синтеза.

26.

• Все цианобактерии обладают способностью к
азотфиксации,
что
делает
их
весьма
перспективными продуцентами белка. Такие
представители
цианобактерий,
как
носток,
спирулина,
триходесмиум
съедобны
и
непосредственно употребляются в пищу.
• В клетках Spirulina содержится 65% белков
(больше, чем в соевых бобах), 19% углеводов, 6%
пигментов, 4% липидов, 3% волокон и 3% золы. Для
белков этих бактерий характерно сбалансированное
содержание аминокислот. Клеточная стенка хорошо
переваривается.
• Растет спирулина в щелочной среде при рН вплоть
до 11, в щелочных озерах она практически
доминирует. Урожайность очень высокая: расчеты
на год показали, что она превысит выход пшеницы
примерно в 10 раз.

27.

Продукты микробиологического
производства
Пищевые продукты
Кисломолочные продукты
Бактерии-продуценты
Соления и маринады
Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Streptococcus spp.,
Lactococcus spp.
Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp.
Уксус
Acetobacter aceti, Gluconobacter suboxidans
Пищевые и кормовые добавки
Аминокислоты
Белок
Витамины
Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum,
Micrococcus spp.
Methylomonas spp., Methylophillus methylotrophus,
Anabaena spp., Spirulina spp.
Clostridium spp., Propionibacterium freudenreichii,
Pseudomonas denitrificans, Bacillus megaterium,
Gluconobacter spp.
Промышленные соединения
Спирты
Zimomonas mobilis, Clostridium spp.
Ацетон
Clostridium spp.
Органические кислоты
Полисахариды
Ферменты
Lactobacillus spp., Acetobacter spp., Clostridium aceticum,
Gluconobacter spp., Propionibacterium spp., Pseudomonas
spp.
Leucomonstoс mesenteroides, Azotobacter vinelandii
Bacillus spp., Streptomyces spp., Actinomyces spp.,
Escherichia coli, Clostridium spp.
Лекарственные препараты
Антибиотики
Streptomyces spp., Bacillus spp.
Биологически активные вещества
Инсектициды
Bacillus thuringiensis

28.

Группа
антибиотиков
Антибиотики
Бактерии-продуценты
Полипептиды
Бацитрацины
Полимиксины
Bacillus licheniformis
Paenibacillus polymyxa,
Bacillus circulans
Bacillus brevis
Streptococcus lactis
Грамицидин С
Низины
Аминогликозиды
Стрептомицин
Неомицины
Канамицины
Гентамицины
Фортимицины
Саннимицины
Сагамицин
Хромопептиды
Актиномицины
Streptomyces griseus
Streptomyces fradiae,
Streptomyces albogriseolus
Streptomyces kanamyceticus
Micromonospora purpurea
Micromonospora olivoasterospora
Streptomyces sannanensis
Micromonospora sagamiensis
Streptomyces antibioticus
Streptomyces chrysomallus
Streptomyces flavus

29.

Тетрациклины
Тетрациклин
Хлортетрациклин
Окситетрациклин
Streptomyces aureofaciens
Streptomyces aureofaciens
Streptomyces rimosus
Макролиды
Эритромицин
Олеандомицин
Магнамицин
Филипин
Streptomyces erythreus
Streptomyces antibioticus
Streptomyces halstedii
Streptomyces filipensis
Анзамицины
Рифампицины
Nocardia mediterranea,
Micromonospora spp.,
Streptomyces mediterranei
Новобиоцин
Streptomyces spheroids

30.

Клавамы
Аугментин
Streptomyces clavuligerus
Карбапенемы
Оливановые кислоты
Тиенамицин
Streptomyces olivaceus
Нокардицины
Нокардицины А, В, D,
Е, F, G
Nocardia spp.
Монобактамы
Азтреонам
Pseudomonas acidophila,
Gluconobacter spp.
Полиены
Нистатин
Streptomyces noursei
Лактамы
Пенициллины
Streptomyces
Nocardia
Pseudomonas spp.
Цефалоспорины
spp.,
spp.,

31.

Группы
ферментов
Ферменты
Бактерии-продуценты
Гликозидазы α-амилаза
Пуллуланаза
β-галактозидаза
Инвертаза
Полигалактуроназа,
Пектин-эстераза
Пектиназы
Bacillus licheniformis
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Bacillus subtilis, B. diastaticus
Clostridium felsineum
Протеазы
Коллагеназа
Аспартаза
Комплекс «римопротелин»
Комплекс «протелин»
Clostridium histolyticum
Escherichia coli
Actinomyces rimosus
Streptomyces griseus
Липазы
Фосфокиназы
Clostridium spp., Bacillus spp.
Негидролитические
ферменты
Фумараза
Глюкозоизомеразы
Escherichia coli
Streptomyces spp., Bacillus spp.
Erwinia spp., Bacillus polymyxa

32. Грибы

• используют
для
получения
таких
продуктов, как:
• - антибиотики (Penicillium spp.);
• - гиббереллины и цитокинины (Fusarium
spp., Botrytis spp.);
• - каротиноиды (астаксантин – Rhaffia
rhodozima,);
• - белок (Candida spp., Saccharomycopsis
lipolytica);
• - спирты (Saccharomyces cerevisiae,
Kluyveromyces fragilis);

33.

• - сыры типа рокфор и камамбер
(Penicillium spp.);
• - соевый соус (Aspergillus oryzae);
• - токсины - афлатоксины В1, В2, G1, G2,
М1 (Aspergillus spp.), трихотеценовые
микотоксины
дезоксиниваленол
и
зеараленон (Fusarium spp.), охратоксины,
цитринин, цитреовиридин (Aspergillus spp.
и Penicillium spp.), алкалоиды спорыньи, в
т.ч. лизергиновая кислота и агроклавин.

34.

• Из 500 известных видов дрожжей первым люди
научились использовать Saccharomyces cerevisiae,
этот вид наиболее интенсивно культивируется. К
дрожжам, сбраживающим лактозу, относится
Kluyveromyces fragilis, который используют для
получения спирта из сыворотки.
• Saccharomycopsis
lipolytica
деградирует
углеводороды и употребляется для получения
белковой массы.
• Промышленные дрожжи обычно не размножаются
половым путем, не образуют спор и полиплоидны,
что определяет их активность и способность
адаптироваться
к
изменениям
условий
культивирования.

35.

• Плесневые грибы в юго-восточной Азии
используют при гидролизе рисового крахмала в
производстве сакэ, гидролизе соевых бобов, риса
и солода. Пищевые продукты на основе
сброженных плесневыми грибами Rhizopus
oligosporus соевых бобов или пшеницы содержат
в 5 - 7 раз больше таких витаминов, как
рибофлавин и никотиновая кислота, отличаются
повышенным в несколько раз содержанием
белка.
• Грибы
также
продуцируют
ферменты,
используемые в промышленности (амилазы,
пектиназы, протеазы и т.д.), органические
кислоты и антибиотики.

36.

• «Жировые дрожжи», относящиеся к родам
Cryptococcus,
Rhodotorula,
Lipomyces,
Sporobolomyces, Trichosporon, как типичные
липидообразователи в нормальных условиях
синтезируют до 40% и более липидов.
• Среди мицелиальных грибов значительные
количества липидов (40-70%) способны
накапливать представители родов Penicillium,
Rhizopus, Fusarium, однако пока они не
получили
широкого
промышленного
распространения, хотя жир грибов по своему
составу близок к растительному.

37.

• Многие грибы способны к сверхсинтезу
витамина B2 с активным выделением его в
среду, но в качестве промышленных
продуцентов употребляют, главным образом,
грибы Eremothecium ashbyii и Ashbya
gossipii.
Среди
грибов
активными
продуцентами рибофлавина также являются
Aspergillus
spр.
Помимо
свободного
витамина, при помощи Е. ashbyii получают
также его коферментные формы ФМН и
ФАД, также широко используемые в
медицине при лечении дистрофии сетчатки
глаза
и
заболеваниях
печени
и
поджелудочной железы.

38.

• Культура мукоровых грибов Blakeslea trispora самый активный промыщленный продуцент βкаротина - провитамина витамина А. Продуцентами
β-каротина
также
являются
дрожжи
рода
Rhodotorula, грибы семейства Mucoraceae и др.
• Эргостерин - провитамин витамина D2 - содержится
в клетках многих дрожжей и его количество в
некоторых случаях может достигать 10 % от сухой
биомассы;
основным
источником
его
промышленного получения служат пекарские и
пивные дрожжи, дрожжи Rhodotorula, Candida и
мицелиальные грибы аспергиллы и пенициллы, в
мицелии которых содержание стеринов может
достигать 2 % в расчете на сухую массу.

39.

Группа
антибиотиков
Лактамы
Антибиотики
Пенициллины
Цефалоспорины
Грибы-продуценты
Penicillium notatum,
Penicillium chrysogenum,
Penicillium bericompactum,
Penicillium nigricans, Penicillium turbatum,
Penicillium steckii, Penicillium orylophilum,
Aspergillus flavus, Aspergillus flavipes,
Aspergillus janus, Aspergillus nidulans
Cephalosporiuт acremonium
Циклопептиды
Циклоспорин А
Cylindrocarpum lucidum,
Tolypocladium inflaturn, Bauveria nives
Стероиды
Фузидиевая
кислота
Fusarium coccineum
Cephalosporium spp.
Цефалоспорин Р
Гризеофульвин
Penicillium griseofulvum.
Трихотецин
Trichothecium roseum

40.

Группы
ферментов
Гликозидазы
Ферменты
Амилазы
Декстраназа
β-галактозидазы
Инвертаза
Пектиназы
Целлюлазы
Грибы-продуценты
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger,
Rhizopus niveus, Endomycopsis sp.
Penicillium purpurogenium
Aspergillus niger,
Saccharomyces cereviceae,
Alternaria tenuis
Aspergillus spр.
Aspergillus spр
Penicillium spp.
Trichoderma roseum,
Verticillium alboatrum
Протеазы
Aspergillus foetidus,
Aspergillus terricola,
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae
Липазы
Candida spp

41. Гетеротрофные протисты

- противоопухолевые препараты круцин и
трепаноза (Trypanosoma cruzi (Schizotrypanum
cruzi)), астазилид (Astasia longa), парамилон
(Astasia spp., Euglena spp.);
- продуценты белка и биологически активных
веществ.
•Относятся к числу нетрадиционных объектов
биотехнологического
использования.
До
недавнего времени они применялись лишь как
компонент активного ила при биологической
очистке сточных вод. В настоящее время они
привлекли внимание исследователей как
продуценты биологически активных веществ.

42.

• Характерной особенностью протистов
является высокое содержание в клетках
ненасыщенных
жирных
кислот,
составляющее у трипаносом 70-80 %, а у
Astasia longa – 60 % от количества всех
жирных кислот, причем у жгутиконосцев
фосфолипиды
и
полиненасыщенные
жирные кислоты имеют такой же состав и
строение, как в организме человека и
высших животных.

43.

• Другой группой биологически активных
веществ протистов являются полисахариды.
Особый интерес представляет парамилон,
характерный для эвгленовых жгутиконосцев.
Представители родов Astasia и Euglena
способны
к
сверхсинтезу
парамилона,
составляющему свыше 50 % сухого остатка
клеток. Парамилон возможно использовать как
стимулятор
иммунной
системы
млекопитающих, обладающий выраженным
противоопухолевым, иммуномодулирующим
действием и низкой токсичностью.

44.

• Биомасса протистов содержит до 50 %
белка.
Его
высокая
биологическая
ценность заключается в том, что он
содержит все незаменимые аминокислоты,
причем
содержание
свободных
аминокислот на порядок выше, чем в
биомассе микроводорослей, бактерий и в
мясе. Это свидетельствует о широких
возможностях
применения
свободноживущих протистов в качестве
источника кормового белка.

45. Водоросли

• - кормовой и пищевой белок (Chlorella spp.,
Scenedesmus spp);
• - пищевые и витаминные добавки (Ulva spp.,
Porfira spp., Undaria spp., Rhodimenia spp.,
Alaria spp.);
• - глицерол (Dunaliella bardawil)
Среди
биотехнологических
штаммов
водорослей, широко используемых во всем мире
для получения ценных медицинских препаратов,
пищевых и кормовых добавок, наибольший
интерес представляют 3 рода - Dunaliella,
Chlorella и Scenedesmus.

46.

• Dunaliella – одноклеточная зеленая водоросль —
объект
массового
промышленного
культивирования для получения витаминов,
липидов, спиртов (в частности, этанола) и
антибиотиков.
Особенно
интенсивно
эта
водоросль используется для получения в
промышленных масштабах глицерола, каротина
и
полиненасыщенных
жирных
кислот,
являющихся предшественниками простагландина и препятствующих развитию атеросклероза
и других заболеваний.
• Для роста этим водорослям необходимы:
морская вода, углекислый газ и солнечный свет.

47.

• Chlorella (С. vulgaris, С. ellipsoidea, С.
руrenoidosa и др.) – одноклеточная зеленая
водоросль – активный продуцент белков,
углеводов, липидов, витаминов с легко
регулируемым соотношением этих соединений
при изменении условий культивирования. В
белке хлореллы имеются все необходимые
аминокислоты, в том числе незаменимые. В
клетках хлореллы присутствуют каротин,
витамины B1, В2, В3, В6, B12, С, D, К, РР, Е,
пантотеновая кислота, фолиевая кислота. По
содержанию витаминов хлорелла превосходит
дрожжи и рекомендуется как терапевтическое и
общеукрепляющее средство, повышающее
иммунный статус организма.

48.

Гидролизаты белка зеленой водоросли
Scenedesmus используются в медицине и
косметической
промышленности.
Их
биомасса после соответствующей обработки
используется в качестве добавки в рационы
сельскохозяйственных животных, а также в
пищевых целях.

49.

• Широко
культивируются
ламинария
и
порфира дальневосточных или северных
морей. Ламинария наряду с хлореллой
является самой популярной съедобной и
кормовой водорослью.
• Одним из самых ценных продуктов,
получаемых из красных водорослей, является
агар – полисахарид, присутствующий в их
оболочках и состоящий из агарозы и
агаропектина. Количество его доходит до 30-40
% от веса водорослей (водоросли анфельция,
лауренция, грацилярия, гелидиум).

50.

• Бурые водоросли являются единственным
источником получения одних из самых ценных
веществ водорослей –
солей альгиновой
кислоты – альгинатов, широко используемых
в различных областях народного хозяйства.
• Бурые водоросли богаты также весьма
полезным соединением — шестиатомным
спиртом маннитом, который с успехом
применяют в пищевой промышленности,
фармацевтике, при производстве бумаги,
красок, взрывчатки и др.

51.

• Выбор процесса ферментации зависит не
только от потребностей организма, но и от
того, для чего будет использована культура, то
есть, от конечной цели технологии.
• 1) по состоянию питательной среды или по
основной фазе (поверхностные и глубинные,
твердофазные и жидкофазные);
• 2) по
наличию
или
отсутствию
перемешивания
(динамические
или
статические);

52.

• 3) по содержанию кислорода (на аэробные и
анаэробные);
• 4) по способу действия (закрытые, чаще
периодические, и открытые, чаще непрерывные);
• 5) по количеству ферментеров (одно-, дву- и
многостадийные);
• 6) по способу управления (тубулярные,
хемостатные, турбидостатные, оксистатные, рНстатные и другие);
• 7) по степени защищенности от посторонней
микробиоты;
• 8) по числу видов микроорганизмов.

53.

• Твердофазная ферментация
Используется в основном для выращивания
грибов. В качестве твердой фазы могут
выступать различные виды растительного
сырья.
Дешевое производство и возможность
использования
субстратов,
которые
непригодны
для
других
способов
культивирования.
Некоторые процессы протекают значительно
интенсивнее.

54.

• Варианты
твердофазного
культивирования:
• 1. Поверхностное («тонкий слой»),
• 2. Глубинное в неперемешиваемом слое
(«высокий слой»),
• 3. Культивирование в перемешиваемой и
аэрируемой массе.

55.

• Преимуществами
такой
ферментации
являются
простота
конструкций
биореакторов (растильных, или бродильных,
камер),
систем
подачи
воздуха
и
регулирования температурно-влажностного
режима.
• К
недостатком
относят
низкую
эффективность использования субстрата и
продуктивность; сложность механизации и
автоматизации
процесса,
сложность
стерилизации, загрузки-разгрузки лотков и
подносов; нестерильность процесса.

56.

Аппарат Шуценбаха: 1 — деревянная коническая
емкость;
2 — слой буковых стружек

57.

• Аппарат Фрингса:
• 1 — корпус; 2 — ложное перфорированное днище; 3 —
слой буковых стружек; 4 — циркуляционный насос; 5 —
змеевик
системы
термостатирования;
6
—
распределительное устройство стружек.

58.

ферментеры для производства уксуса

59.

• В статических твердофазных процессах
роль биореакторов выполняют большие,
площадью до нескольких кв. метров, лотки,
или
подносы,
из
алюминия
или
культивационные камеры. При твердофазной
ферментации
процесс
протекает
в
вентилируемых растильных камерах, в
которых на стеллажах размещают лотки с
твердой средой. Для лучшей аэрации среды
подаваемый в камеру воздух проходит через
перфорированное днище лотков.

60.

• В большинстве твердофазных процессов
отсутствует
перемешивание,
рост
микроорганизмов происходит по принципу
колонизации: по мере размножения они
распространяются из точек внесения в
субстрат по всему его объему. При этом
отдельные зоны в толще субстрата избыточно
населяются клетками и возникает локальная
нехватка питательных ресурсов, значительная
часть субстрата остается незатронутой.

61. Твердофазный биореактор

62.

Через субстрат с
посевным материалом, размещенный
на модульных основаниях, пропускают увлажненный
воздух, обеспечивающий равномерное
аэрирование и регуляцию температуры.

63.

• Жидкофазная поверхностная
ферментация
• Поверхностные жидкофазные процессы в
биотехнологических производствах используют
для выращивания мицелиальных грибов при
получении органических кислот, ферментных
препаратов, кормовой биомассы. Для этих
целей
применяется
кюветный
способ
культивирования.
Среда
загружается
в
стерильные кюветы, размещаемые на открытых
стеллажах
в
растильных
камерах
с
регулируемым
температурно-влажностным
режимом.

64.

• Вентиляцию помещений осуществляют
очищенным и стерильным воздухом,
который
одновременно
выполняет
функцию теплового агента.
• Микроорганизмы растут в виде пленки
биомассы на поверхности жидкой
питательной среды.
• После
завершения
процесса
культуральная жидкость сливается из
кювет через вмонтированные в днища
штуцеры и поступает на обработку.

65.

• Процессы суспензионной или глубинной
ферментации
• 1) периодическая ферментация;
• 2) продленная оптимизированная периодическая ферментация с подпиткой или
диализом;
• 3) многоциклическая ферментация;
• 4) полунепрерывная ферментация;
• 5) непрерывная ферментация.

66.

• Периодическая ферментация
• Периодический метод предусматривает внесение
посевного материала в питательную среду
(инокуляция клетками среды) в начале процесса и
получение культуры по достижении заданной фазы
развития популяции.
• Концентрация микроорганизмов в периодической
культуре нарастает и останавливается либо из-за
лимитирования
субстратом,
либо
из-за
ингибирования
токсичными
продуктами
жизнедеятельности.
• Практически
все
системы
периодической
ферментации являются закрытыми, поскольку
микроорганизмы в них размножаются и проходят
все фазы развития без притока питательной среды
и оттока культуральной жидкости.

67. Многоциклическая ферментация

• Многоциклическими процессами ферментации
называют такие, в которых цикл выращивания
культуры
повторяется
многократно
без
многократной стерилизации емкости.
• Зависимость концентрации микроорганизмов и
удельной скорости роста от времени в каждом
цикле многоциклического процесса имеет
характер,
аналогичный
таковому
в
периодическом процессе.

68. Продленная периодическая оптимизированная ферментация

• Продленный периодический процесс, как и
периодический, предусматривает одноразовую
загрузку и разгрузку ферментера. Однако цикл
развития микроорганизмов в продленном
периодическом процессе удлиняется либо за счет
подпитки (периодической или непрерывной),
либо за счет длительного удержания клеток в
системе (диализ).

69.

• Ферментация с подпиткой
• Если зависимость удельной скорости роста от
количества субстрата имеет насыщение, то
исходную концентрацию субстрата можно задать
сразу побольше в пределах плато, где влияние
субстрата на скорость роста биомассы невелико
или вообще отсутствует. В этом случае пока
концентрация
субстрата
не
снизится
до
критического уровня подпитку можно не
производить.
• Если зависимость удельной скорости роста
биомассы от концентрации субстрата имеет
экстремум, то подпитка требуется уже с самого
начала процесса для поддержания его на
оптимальном уровне.
• Подпитка может осуществляться импульсно или по
каплям на протяжении всего процесса.

70.

• Варианты управления подпиткой:
• 1. Заранее рассчитывается программа
изменения подпитки во времени, и субстрат
подается в аппарат без информации о том, с
какой скоростью его потребляет культура.
Это может привести как к избытку, так и к
недостатку субстрата в среде.
• 2. Субстрат подается по одному из
косвенных параметров, связанных с ростом
культуры.
• Ферментация
подпитками.
с
повторяющимися

71. Диализные системы

• Суть этого метода заключается в том, что
культура развивается в пространстве,
ограниченном
полупроницаемой
мембраной, а продукты диффундируют во
внешний раствор.
• Диализные мембраны задерживают клетки
и макромолекулы, но проницаемы для таких
мелких молекул, как основные питательные
компоненты,
требующиеся
микроорганизмам для их роста.

72. Диализные мембраны

• Диализные мембраны изготавливают из
пергамента, целлофана,
ацетатцеллюлозы,
полиамида, поликарбоната, кремния и др.
• Для микробиологических целей следует
принимать во внимание такие факторы, как
автоклавируемость мембран, размер их пор,
высокий уровень отсечки, химическая
инертность и проницаемость (которая в
свою очередь определяется пористостью,
емкостью и толщиной мембраны), а также
наибольший экономический коэффициент.

73.

• Диализные культуры применяются в основном
в трех случаях:
• 1) для концентрирования недиффундирующего
продукта,
• 2)
для
уменьшения
концентрации
диффундирующего продукта, ингибирующего
рост клеток, и повышения выхода биомассы,
• 3) для накопления и отделения от клеток
диффундирующего продукта.

74.

• Преимущества процесса диализа: 1)
отсутствие органических растворителей;
2) возможность высокой степени очистки
клеток от примесей низкомолекулярных
соединений, солей и металлов.
• Недостатки:
1)
низкая
скорость
диализа, определяемая молекулярной
диффузией; 2) возможность обрастания
диализных мембран и забивания их пор.

75.

• Для
повышения
эффективности
диффузионного способа культивирования
объем диализной жидкости должен быть
значительно больше объема диализуемой
культуры, или же диализную жидкость
следует менять.
• Кроме того, мембраны должны иметь
достаточную
площадь,
чтобы
обеспечивалась
удовлетворительная
скорость диффузии.

76. Электродиализ

• Некоторых недостатков диализа удается избежать за счет применения
электродиализа (Доре, 1910). В этом случае параллельно мембранам
и диализуемой жидкости накладывается электрическое поле, в
результате чего анионы и катионы из раствора диффундируют через
диализные мембраны к аноду и катоду, а клетки остаются в растворе.
В простейшем случае электродиализатор состоит из 3 камер,
отделенных друг от друга полупроницаемыми мембранами –
центральной для обрабатываемого раствора, а также для пермеата в
зоне анода и пермеата в зоне катода по обеим сторонам от
центральной камеры. Мембраны при катоде и при аноде могут быть
выполнены из разного материала, селективного для катионов и
анионов.
• Недостатком электродиализа является выделение при высоком
напряжении большого количества тепла, что может привести к
необратимым изменениям в системам с биологическими
компонентами.

77. Полунепрерывная ферментация

• В полунепрерывных системах полная загрузка и
разгрузка ферментера осуществляются однократно,
однако в процессе роста культуры часть ее
сливается, а освободившийся объем заливается
свежей питательной средой, т.е. функционирует
отъемно-доливная или сливно-доливная система.
• Следовательно, полунепрерывная ферментация
характеризуется частотой и объемом сливаемой
выросшей культуры и добавлением свежей
питательной среды в рабочую емкость ферментера,
а также колебанием концентрации биомассы около
одной и той же постоянной величины и
относительным постоянством средней удельной
скорости роста популяции.

78. Непрерывная ферментация

• В отличие от периодического в непрерывных
процессах
питательная
среда
подается
непрерывно, удаление биомассы и продуктов ее
жизнедеятельности
также
осуществляется
непрерывно.
• По
такому
принципу
организуются
2
разновидности
процессов
непрерывной
ферментации : процессы полного (идеального)
смешения или хемостатные процессы и
процессы полного вытеснения или тубулярные
процессы.

79.

• Хемостатные процессы
непрерывной ферментации
• Гомогенные системы идеального
смешения
• Если в процессе непрерывной ферментации
плотность популяции клеток определяется
химическим составом среды (концентрацией
лимитирующего рост фактора), его называют
хемостатным.
Изменяя
концентрацию
лимитирующего рост фактора, можно изменять
плотность популяции, т.е. изменяя скорость
разбавления,
можно
получать
режимы,
обеспечивающие различную скорость роста
популяции.

80.

• Установившиеся
режимы
непрерывной
ферментации характеризуются постоянством
концентрации микроорганизмов и удельной
скорости роста популяции, поскольку клетки
растут в биореакторе при интенсивном
перемешивании в культуральной среде,
постоянной
по
своему
составу,
и,
следовательно, в каждый данный момент
времени находятся в одном и том же
физиологическом состоянии, т.е. в состоянии
установившегося динамического равновесия.

81.

• Самым распространенным и типовым
способом непрерывной ферментации на
протоке среды является хемостат.
• В установившемся режиме скорость
протока среды, отнесенная к единице
объема
культуры
в
ферментере,
называется коэффициентом разбавления
(D) и равняется удельной скорости роста.

82.

• В хемостате практически можно только
приблизиться к максимальной удельной
скорости роста, но не достичь ее, потому
что такая скорость роста соответствует
критической скорости разбавления, при
которой
биомасса
вымывается
из
ферментера, что является одним из
существенных недостатков хемостата.

83.

• Для борьбы с данным явлением возможно
использовать
комплекс
«ферментерсепаратор». В этом комплексе выходящая из
ферментера
жидкость
сгущается
на
сепараторе, и часть сгущенного потока
непрерывно возвращается в ферментер,
остальная часть идет как товарный продукт.
Основными направлениями использования
рециркуляции
являются:
повышение
производительности системы непрерывного
культивирования и более полное потребление
субстрата из среды.

84.

• Одностадийный хемостат применяется при
необходимости
воспроизвести
любую
скорость
роста
клеток,
кроме
максимальной. Двухстадийный позволяет
создавать культуры при скорости роста,
близкой к максимальной, и определять
условия ее повышения. Для этого в первом
ферментере ведется культивирование при
скорости разбавления, меньшей чем
удельная скорость роста, а во второй
подается культура из первого.

85.

• Особенности двухстадийного хемостата:
• 1. Вымывания культуры во втором ферментере не
происходит из-за непрерывного поступления
культуры
из
первого.
Следовательно,
концентрация биомассы никогда не сможет стать
равной нулю при любой скорости разбавления.
Будет возрастать удельная скорость роста клеток
и экономический коэффициент.
• 2. Концентрация субстрата во втором аппарате
меньше, чем в первом. Субстрат расходуется из
запаса входящего потока. Это имеет значение в
тех случаях, когда важен не только выход
биомассы, но и ее чистота.
• 3. Концентрация биомассы во втором аппарате
всегда выше, чем в первом (учитывается прирост
биомассы).

86.

87.

• Другой
широко
известный
принцип
управления процессом – турбидостат. В нем
подача питательной среды осуществляется по
команде
фотоэлектрического
элемента,
регистрирующего
оптическую
плотность
культуры.
Скорость
разбавления
сама
устанавливается в соответствии с заданной
плотностью популяции.
• Этим турбидостат отличается от хемостата, в
котором фиксируется скорость разбавления,
соответственно
которой
устанавливается
концентрация биомассы.

88.

• Турбидостат
позволяет
получать
максимальные скорости роста, которые
применяются
при
культивировании
клеточных культур, фиксированных в
стадии
экспоненциального
роста.
Хемостаты же применяют при скоростях
разбавления от самой низкой до только
приближающейся
к
максимальной
удельной скорости роста.

89.

Схема работы турбидостата:
• So – концентрация субстрата в подаваемой среде,
• S1 – концентрация субстрата в вытекающей культуре,
• Х – концентрация клеток.

90.

• В настоящее время разработаны различные
варианты
непрерывного
культивирования
микроорганизмов, работающие по принципу
турбидостата – pH-стат, оксистат, СО2стат, теплостат, респиростат, вискозистат
и т. д., названия которых соответствуют
задаваемому параметру. Любой параметр,
который изменяется в периодической культуре и
на который существует датчик, может быть
использован для управления ростом по типу
турбидостата.
• Управляющими параметрами могут быть
комплексные параметры, например, содержание
кислорода и углекислоты в отходящем воздухе,
характеризующие дыхательный коэффициент.

91.

• Тубулярные процессы непрерывной
ферментации
• Системы полного вытеснения
Этот способ используется для анаэробных условий.
Открытая система полного вытеснения отличается
от системы идеального смешения тем, что культура
в ней не перемешивается и представляет собой
поток
жидкости
через
трубку.
Наиболее
распространенным аппаратом является трубчатый
реактор, который может иметь различную форму
(прямую,
S-образную,
спиральную)
и
устанавливается горизонтально или вертикально.
Питательная
среда
и
посевной
материал
смешиваются на входе и непрерывно поступают в
аппарат без обратного смешения. В аппарате
башенного типа жидкость движется снизу вверх.

92.

• Система полного вытеснения представляет
собой
пространственный,
проточный
вариант периодической культуры. Такая
культура за время от посева до выгрузки
проходит через все стадии периодической
культуры, т. е. фазы роста распределены не
во времени, а в пространстве, причем
каждой части ферментера в установившемся
режиме
соответствует
определенный
отрезок ростовой кривой.

93.

• Трубчатый ферментер полного вытеснения:
• So – концентрация субстрата в поступающей среде,
• S – концентрация субстрата в вытекающей среде,
• Хо – начальная концентрация биомассы,
• Хо – концентрация вытекающей биомассы.

94.

• Преимуществом тубулярного процесса
является возможность более полного
исчерпания
субстрата
(как
и
в
периодическом процессе), недостатком
– большая склонность к контаминации и
невозможность организовать аэрацию по
всей длине аппарата.

95.

• Культуры клеток высших растений
• Основные
направления
создания
современных
биотехнологий на основе культивируемых клеток
растений:
• 1. Получение биологически активных веществ
растительного
происхождения:
- традиционных продуктов вторичного метаболизма
(токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов,
стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское
применение);
• - новых необычных соединений, что возможно
благодаря
исходной
неоднородности
клеточной
популяции,
генетической
изменчивости
культивируемых клеток и селективному отбору
клеточных линий со стойкими модификациями, а в
некоторых случаях и направленному мутагенезу.

96.

• Кроме того, суспензионные культуры могут
применяться как мультиферментные системы,
способные
к
широкому
спектру
биотрансформаций химических веществ, в
результате
чего
получают
уникальные
биологически активные продукты на основе
синтетических соединений или веществ
промежуточного обмена растений.
• 2. Ускоренное клональное микроразмножение
растений, позволяющее из одного экпланта
получать от 10000 до 1000000 генетически
идентичных растений в год.
• 3. Получение безвирусных растений.

97.

• 4.
Использование
эмбриокультуры
и
оплодотворения in vitro для преодоления
постгамной несовместимости или щуплости
зародыша при получения растений после
отдаленной гибридизации.
• 5. Антерные культуры – культуры пыльников и
пыльцы – используются для получения
гаплоидов и дигаплоидов.
• 6. Клеточный мутагенез и селекция. Тканевые
культуры
в
результате
сомаклонального
варьирования позволяют получать регенеранты,
фенотипически и генотипически отличающиеся
от исходного материала, даже без мутагенной
обработки.

98.

• 7. Криоконсервация и другие методы сохранения
генофонда.
• 8. Иммобилизация растительных клеток.
• 9. Соматическая гибридизация на основе
слияния растительных протопластов.
• 10. Конструирование клеток путем введения
различных клеточных органелл.
• 11.
Генетическая
трансформация
на
хромосомном и генном уровнях.
• 12. Изучение системы «хозяин – паразит» с
использованием вирусов, бактерий, грибов и
насекомых).

99.

• Методы создания клеточных культур
растений
• Методы
культивирования
изолированных
фрагментов
растений
основаны
на
исследовании
такого
важного
свойства
растительной клетки, как тотипотентность
(свойство клетки реализовывать генетическую
информацию,
обеспечивающую
ее
дифференцировку и развитие до целого
организма). В экспериментальных условиях при
выращивании эксплантов возможна реализация
супрессированной в естественных условиях
тотипотентности под действием фитогормонов.

100.

Морфогенетические пути развития клетки in vitro

101.

102.

Основным
типом
культивируемой
растительной клетки является каллусная, в
результате деления которой возникает каллус.
Для растения каллус является тканью,
возникающей под действием «раневых
гормонов»
путем
неорганизованной
пролиферации клеток при исключительных
обстоятельствах
и
функционирующей
непродолжительное
время.
Эта
ткань
защищает травмированное место, накапливает
питательные вещества для анатомической
регенерации.

103.

• Каллус на травмированной
виноградной лозе

104.

105.

106.

107.

• Культура
каллусных
клеток
–
это
неорганизованная пролиферирующая ткань,
состоящая из дедифференцированных клеток. В
дальнейшем
они
специализируются
как
каллусные, т.е. дифференцируются.
• Значительно
реже
культивируют
клетки
опухолей растений различного происхождения
(растительные – бактериальной или вирусной
этиологии; генетические, возникающие на
межвидовых гибридах). Культуры опухолевых
клеток независимо от способа культивирования
на уровне морфологии мало отличаются от
культур каллусных клеток.

108.

• Значительным их
физиологическим
отличием
является
гормононезависимость, позволяющая им делиться и
расти на питательных средах без добавок
фитогормонов или их аналогов. Однако
опухолевые клетки лишены способности
давать начало нормально организованным
структурам. В некоторых случаях они
способны образовывать тератомы.

109.

110.

• Каллусные клетки способны делиться только при
наличии в питательной среде фитогормонов.
Однако при длительном культивировании в
некоторых случаях они могут утрачивать
зависимость от наличия в среде ауксинов и
цитокининов. Такие клетки принято называть
«привыкшими». В них также как и в опухолевых
клетках идет интенсивный синтез собственных
гормонов.
Часто
ткани,
образованные
«привыкшими»
клетками,
называют
химическими опухолями. Подобно опухолевым,
такие ткани не способны к нормальной
регенерации и образуют тератомы.

111.

• Для получения культивируемых каллусных
клеток фрагменты тканей различных
органов высших растений - корней,
листьев, стеблей, пыльников, зародышей
(экспланты) помещают на искусственную
среду, содержащую фитогормоны, в
пробирки, колбы, чашки Петри.

112. Экспланты

113.

• Процесс получения первичного каллуса и
поддержание пересадочной культуры требует
строго стерильных условий.
• До извлечения экспланта часть растения
предварительно
промывают
водой
с
детергентом,
а
затем
ополаскивают
стерильной
водой.
Затем
выделенные
экспланты помещают в стерильные растворы,
содержащие хлор или ртуть, к которым для
лучшего смачивания добавлены детергенты.

114.

• После
выдерживания
эксплантов
в
дезинфицирующем растворе их несколько раз
промывают стерильной дистиллированной
водой и скальпелем стерильно удаляют на
срезах несколько слоев клеток.
• В случае внутреннего инфицирования тканей
принято использовать антибиотики, хотя это и
не всегда позволяет получить стерильный
эксплант.
• Основным
условием
превращения
растительной клетки в каллусную является
присутствие
в
питательной
среде
фитогормонов.

115.

• Ауксины
вызывают
процессы
дедифференцировки клетки, готовящие ее к
делению, а цитокинины – пролиферацию
дедифференцированных клеток.
• Если
эксплант,
состоящий
из
дифференцированых клеток, поместить в
питательную среду без гормонов, деление
клеток не произойдет, и каллус не образуется.
• Таким
образом,
превращение
специализированной клетки в каллусную
связано с возобновлением под влиянием
фитогормонов клеточного деления.

116.

• В качестве ауксинов используют 2,4дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), άнафтилуксусную
кислоту
(НУК),
индолилмасляную
кислоту
(ИМК),
индолилуксусную
кислоту
(ИУК)
в
концентрации 0,5 - 10 мг/л в зависимости от
вида экспланта. В качестве цитокининов
применяют зеатин, кинетин и др.
• Процесс перехода к каллусному росту
начинается с остановки клеточных делений.
Лаг-фаза продолжается 24-48 часов, в течение
которых клетки увеличиваются в размерах и
ткань экспланта разрыхляется. Далее клетки
начинают быстро делиться, образуя каллусную
ткань.

117.

• Характерной особенностью каллусной ткани
является выраженные гетерогенность по
возрасту и генетическая гетерогенность
(клетки различаются по числу хромосом, что
связано с неорганизованным, несинхронным,
анархичным
развитием).
Встречают
диплоидные, полиплоидные и анеуплоидные
клетки, причем, чем длительнее процесс
культивирования, тем сильнее различие
клеток по плоидности.
• Одной из причин гетерогенности культуры
каллусной
ткани
является
различное
тканевое
происхождение
первичных
каллусных клеток.

118.

Первичный каллус, возникший на эксплантах
через 4-6 недель (в зависимости от скорости
роста клеток) переносится на свежую
питательную
среду
(пассируется
или
субкультивируется).
Размер
транспланта
(переносимого
фрагмента)
при
культивировании
на
агаризованной
питательной среде обычно составляет от 60 до
100 мг массы ткани на 30-40 мл питательной
среды.
• В процессе субкультивирования формируется
штамм, характеризующийся индивидуальными
генетическими
и
физиологическими
особенностями.

119.

• Большинство каллусных клеток могут расти в
условиях сильного освещения или в темноте,
поскольку не способны фотосинтезировать.
Однако свет может выступать как фактор,
обеспечивающий морфогенез и активирующий
процессы вторичного синтеза. Для достижения
оптимизации процесса культивирования часто
используют
люминесцентные
лампы
с
интенсивностью около 1000 люкс и непрерывным
«холодным белым» светом.
• Для роста и развития большинства каллусных
культур оптимальной является температура 26 °С.
Однако индукция процессов морфогенеза требует
более низких температур (18-20 °С).

120.

• Оптимальная влажность в культуральной
лаборатории должна составлять 60-70 %.
Большое
значение
для
успешного
культивирования каллусных клеток также
имеет аэрация.
• Клетки потребляют меньше кислорода
по сравнению с нормальными клетками,
что свидетельствует о снижение эффекта
Пастера.

121.

• При культивировании растительных
клеток и при выращивании культуры
тканей применяются среды МурасигеСкуга, Нагата-Такебе, Хеллера, НичаНича, Кнудсона и другие в различных
модификациях.

122.

• Основными компонентами питательных
сред для культуры клеток и тканей
растений являются минеральные соли
(макро- и микроэлементы), источник
углеродного питания (обычно сахароза
или глюкоза), витамины, регуляторы
роста. Иногда в состав питательных сред
включают комплексные органические
добавки (гидролизат казеина или смесь
аминокислот,
дрожжевой
экстракт,
экстракты из разных органов растения).

123.

• Методы выращивания культур
растительных клеток

124.

• Поверхностное культивирование
• Культура каллусных тканей выращивается
поверхностным способом на полужидкой
агаризованной среде (концентрация агарагара 0,6-1%), среде с применением
других желирующих полимеров либо на
мостиках из фильтровальной бумаги или
дисках из пенополиуретана, погруженных
в жидкую питательную среду.

125.

• Каллусная
ткань,
выращиваемая
поверхностным способом, представляет собой
аморфную массу тонкостенных паренхимных
клеток, не имеющую строго определенной
анатомической структуры. Цвет массы может
быть белым, желтоватым, сероватым –
пигментированным полностью или зонально.
Темно-коричневая окраска каллуса возникает
чаще при старении каллусных клеток или
неоптимальных условиях выращивания и
связана с накоплением в них фенолов,
окисляющихся до хинонов. Для избавления от
них
в
питательные
среды
вводятся
антиоксиданты.

126.

127.

128.

•Неорганизованно растущая каллусная ткань
характеризуется тремя типами клеток:
•мелкими,
•средними,
•крупными.
•При пассировании ткани на среду, содержащую
индукторы органогенеза, мелкие клетки
приступают к делению и формируют
меристематические очаги. Деление клеток
меристематического очага приводит либо к
формированию
почек
и
последующему
развитию из них побегов (геммогенез), либо к
ризогенезу.

129.

• Каллусы с высоким морфогенетическим
потенциалом обычно матовые, компактные,
структурированные,
имеют
зеленые
хлорофиллсодержащие участки, которые
представляют собой зоны морфогенеза.
Рыхлые каллусы, не имеющие глобулярного
характера, либо совсем не способны к
органогенезу, либо формируют только корни.
Эти каллусы могут остаться ризогенными, и
регенерировать из них растения не удастся.
Неморфогенные
каллусы
могут
быть
переведены в суспензионную культуру для
получения вторичных метаболитов.

130.

• В отношении гормональной регуляции
органогенеза Скугом и Миллером в 1957 г.
была выдвинута концепция, которая в
настоящее время известна как «гипотеза
гормонального баланса, или правило
Скуга-Миллера».
• Согласно
данной
концепции,
изменяя
относительное содержание ауксинов и
цитокининов, можно получить образование
стеблей, корней или недифференцированный
рост каллуса.

131.

132.

• Ризогенный каллус

133.

• Геммогенный каллус

134.

• Гемморизогенный каллус

135.

• Суспензионное культивирование
• Культуры клеток растений, выращиваемые в
жидкой
питательной
среде,
обычно
называют
суспензионными
культурами.
Получено еще сравнительно мало культур
клеток высших растений, по своим
параметрам полностью удовлетворяющих
требованиям суспензионного (глубинного)
культивирования. В значительной мере это
объясняется
трудностями
получения
культуры
клеток,
состоящей
преимущественно из отдельных клеток или
небольших их агрегатов.

136.

• Обычно для получения суспензионной
культуры
используются
рыхлые
обводненные каллусные ткани.
• Оптимальными подходами для получения
суспензии
являются
выращивание
каллусов на среде с 2,4-Д, исключение из
среды
ионов
кальция,
обработка
пектиназой
транспланта,
предназначенного для выращивания в
суспензионной культуре.

137.

• Для получения культуры клеток берется
наиболее жизнеспособная (пролифелирующая)
часть каллусной ткани, а ее количество должно
быть в 15-20 раз больше в расчете на объем
питательной среды, чем при серийном
культивировании на агаре (примерно 2-3 г
свежей массы каллусной ткани на 60-100 мл
жидкой питательной среды или примерно 0,52,5х105 кл/мл).
• При этом может использоваться питательная
среда для поверхностного культивирования, но в
некоторых случаях увеличивают количество
ауксинов и (или) уменьшают количество
цитокининов.

138.

• Режим перемешивания и аэрации как при
инициации культуры клеток, так и при
дальнейших
серийных
субкультивированиях
обеспечивается
выращиванием на роллерах и качалках
(круговая качалка – 10-12 об/мин). Часто
интенсивность перемешивания повышается
до 100-120 об/мин.

139. Суспезионная культура

140.

• Образование
первичной
суспензии
растительных клеток можно считать
результатом трех процессов:
• 1) распадение каллусной ткани на клетки
и небольшие клеточные агрегаты в
момент внесения в жидкую питательную
среду;
• 2) отделение клеток и клеточных
агрегатов с поверхности кусочков ткани в
течение первых субкультивирований;

141.

3)
деления
и
роста
клеток,
образовавшихся по первым двум
способам, и распадения разрастающихся
клеточных агрегатов на более мелкие
агрегаты и клетки. Последний процесс
является
типичным
для
роста
стабилизировавшейся
перевиваемой
культуры клеток высших растений.

142.

• Первичную суспензию перед субкультивированием в специальном цилиндре разделяют на
фракции по скорости седиментации (используют
верхнюю фракцию) либо фильтруют через 1-2
слоя марли, нейлоновые или металлические сита,
чтобы избавиться от крупных плотных кусков
каллусной ткани, остатков экспланта и очень
крупных агрегатов.
• Фильтрование рекомендуется до приобретения
клеточной
суспензией
желательных
характеристик. Агрегированность суспензии
зависит не только от характеристик начальной
линии, но и от условий культивирования.

143.

• По степени агрегированности выделяют:
• мелкоагрегированную культуру (40% одиночные клетки, 60%
- мелкие
агрегаты);
• среднеагрегированную культуру (40% одиночные клетки, 40%
- мелкие
агрегаты, 20% - крупные агрегаты);
• крупноагрегированную культуру (40% мелкие агрегаты, 60%
- крупные
агрегаты агрегаты).

144.

• Для глубинного культивирования растительных
клеток применяются способы, разработанные
для микробиологических целей. Используются
закрытые
или
открытые
системы
в
периодическом или проточном режимах.
Однако
при
глубинном
выращивании
растительных клеток принцип турбидостата
практически не применяется. Выращивание
суспензии клеток растений в установках
непрерывного культивирования по принципу
хемостата применяется при промышленном
выращивании клеточной биомассы с целью
получения экономически важных продуктов.

145.

• Признаками
качественной
суспензионной
культуры служат способность клеток к
перестройке метаболизма и высокая скорость
размножения
в
конкретных
условиях
культивирования.
• Морфологические характеристики такой
культуры:
• высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в
группе);
• морфологическая
выравненность
клеток
(небольшие
размеры,
сферическая
или
овальная форма, плотная цитоплазма);
• отсутствие трахеидоподобных элементов.

146.

• Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее
клеток бактерий, кроме того, их размеры
меняются в процессе онтогенеза. Если в начале
экспоненциальной фазы роста они мелкие и
плотные, то в стационарной фазе роста они
сильно
увеличиваются
в
размерах
и
вакуолизируются.
• Чем крупнее становится клетка, тем больше
возрастает
опасность
ее
механического
повреждения в процессе перемешивания. В то
же время клетки растений, крупные и тяжелые,
требуют эффективного перемешивания.

147.

• На культуры некоторых типов клеток
отрицательное влияние может оказывать
механический стресс при выращивании в
ферментере с турбинными мешалками
при скоростях перемешивания свыше 100
об/мин.
Для
таких
культур
целесообразнее
использовать
мягкое
перемешивание
и
аэрацию
пневматическим
способом
потоком
сжатого стерильного воздуха, подаваемого
в ферментер.

148.

• К сожалению, и этот способ имеет свой
недостаток, потому что в культуральной
среде возникает избыток воздуха,
приводящий к кислородному голоданию,
а от концентрации кислорода в среде
зависят рост и вторичный метаболизм
клеток. Высокая степень аэрации также
может оказывать негативное действие на
рост и синтез продуктов вторичного
метаболизма.

149.

• Отличительная особенность суспензионных
культур клеток растений — высокая плотность,
необходимая для роста. Поэтому другим
осложнением при культивировании клеток
растений является увеличение вязкости,
сопровождающее рост биомассы. Это ведет к
адгезии клеток друг к другу и к поверхностям
культурального
сосуда.
С
увеличением
биомассы клеток снижается интенсивность
перемешивания, что в конце концов может
привести культуру к гибели.

150.

• Клетки растений обладают меньшей
физиологической
и
метаболической
активностью
по
сравнению
с
микроорганизмами.
• Время генерации растительной клетки в 60100 раз превосходит время генерации
микробной клетки.
• Пул
пролиферирующих
клеток
не
превышает 50-60%, многие клетки быстро
прекращают деление и переходят в фазу
покоя.

151.

• Суспензионные культуры наиболее часто
используют для промышленного получения
вторичных
метаболитов.
Вещества,
продуцируемые
растительными
клетками,
применяются в медицине, парфюмерной
промышленности, растениеводстве и других
отраслях промышленности. К ним относятся:
алкалоиды,
терпеноиды,
гликозиды,
полифенолы, полисахариды, эфирные масла,
пигменты,
антиканцерогены
(птотецин,
харрингтонин),
пептиды
(ингибиторы
фитовирусов).