Лабораторная диагностика инфекций, передающихся половым путем

1. ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России. Кафедра фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой. Лабораторная диагностика и

ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России.
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии с
лабораторной диагностикой.
Лабораторная диагностика
инфекций, передающихся половым
путем.
Ассистент кафедры
Судьбина И.А.
Самара, 2013.

2. Венерология -область медицины, изучающая заболевания, передающиеся половым путем.

К ним относятся:
Сифилис
Гонорея
Хламидиоз
Трихомониаз
Микоплазмоз
Уреаплазмоз
Герпетическая инфекция
ВИЧ-инфекция
Инфекция, вызванная ВПЧ
Кандидоз
Цитомегаловирусная инфекция
Гератиты B, C и др.

3. Основные проблемы современной венерологии:

Эпидемический рост сифилиса;
Появление «новых» ЗППП, ранее в России не
регистрировавшихся;
Резкое омоложение носителей;
Существенные перемены в социальном и имущественном
статусе пациентов с ЗППП;
Повышение вероятности вспышки СПИД;
Одновременное обнаружение у пациента нескольких инфекций;
Трудности регистрации и контроля ЗППП в современных
условиях.

4. Современные задачи лабораторной диагностики ИППП

интенсифицирование
исследований в области
современных
серологических методик;
развертывание
иммуномолекулярных
методов исследования,
использование ДНК-зондов,
полимеразой цепной реакции
(ПЦР), лигазной цепной
реакции и т.п.;
необходимо создание
системы сертификации
диагностических методов и
подготовки
квалифицированных
специалистов.

5. Сифилис

– общее инфекционное
заболевание, склонное к
хроническому
рецидивирующему течению с
характерной периодизацией
клинических симптомов.

6. Морфология возбудителя

Treponema pallidum:
длина - 7 -14 мкм;
толщина – 0.2-0.5 мкм;
количество завитков – 8-14.
Трепонема покрыта трехслойной
мембраной, клеточной стенкой и
мукополисахаридным
капсулоподобным веществом.
Имеет выраженную подвижность.

7. Методы обнаружения бледных трепонем

прямые тесты, основанные на непосредственном выявлении
возбудителей в очагах поражения;
непрямые тесты (серологические), основанные на выявлении
АТ к возбудителю сифилиса в сыворотке крови, которые в свою
очередь, представлены двумя классами:
- нетрепонемные;
- трепонемные.

8. Прямые методы

1. Темнопольная микроскопия.
Прямая визуализация патогенных
трепонем является широко
используемым и доступным
методом бактериологического их
обнаружения. Он заключается в
исследовании возбудителя
сифилиса непосредственно в
тканевой жидкости из высыпных
элементов, подозрительных на
сифилитические проявления.

9. Прямые методы

2.
Тест на Т. pallidum с
флюоресцентными
антителами (DFA-TP) использует
флюоресцеинконъюгированные АТ
для окраски микроорганизма в
мазках и срезах тканей. DFA-TP не
требует подвижных организмов,
является более чувствительным и
специфичным, но более дорогим и
технически сложным, чем
темнопольная микроскопия.

10. Прямые методы

3.
Заражение животных. Биологический метод диагностики (RIT
- заражение кроликов материалом от больных), несмотря на
его высокую чувствительность, применяется весьма
ограничено из-за таких факторов, как длительность
получения результатов и высокая стоимость. Он практически
не используется в настоящее время.

11. Непрямые методы (серологическая диагностика). Нетрепонемные тесты

Реакция связывания комплемента с кардиолипиновым АГ
РСКк);
Реакция микропреципитации (РМП, МР) с кардиолипиновым
антигеном.

12. Непрямые методы. Нетрепонемные тесты.

Реакция микропреципитации (МР) позволяет выявить АТ к
кардиолипиновому АГ бледной спирохеты. МР при
изолированном применении служит не диагностическим, а
отборочным тестом, в связи с чем на основании её
позитивности диагноз сифилиса не устанавливают, а пациенту
проводят диагностические тесты (РПГА, ИФА). С помощью МР
обследуют лиц, подлежащих периодическим медицинским
осмотрам на венерические заболевания, больных
соматическими заболеваниями и др.

13. Непрямые методы. Нетрепонемные тесты.

Существует несколько вариантов микрореакций:
- VRDL (Venereal Disease Research Laboratory);
- TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test);
- RST (Reagin Screen Test);
- RPR (Rapid Plasma Reagin)
В данных тестах обнаруживаются IgG- и IgM-АТ к липидам
клеточной стенки Т. pallidum, которые появляются в крови
примерно через 1 неделю после формирования твердого
шанкра. Флоккуляционные (хлопьеобразующие) методики для
обнаружения этих АТ к фосфолипидам были разработаны
как неспецифичные скрининговые тесты. Реактивность в этих
тестах обычно указывает на повреждение тканей и не всегда
специфична в отношении сифилиса.

14. Непрямые методы. Нетрепонемные тесты.

15. Непрямые методы. Нетрепонемные тесты.

16. Непрямые методы. Нетрепонемные тесты.

Ложноположительная реакция микропреципитации возможна при
следующих состояниях:
- ревматические заболевания (например, СКВ, ревматоидный
артрит, склеродермия);
- инфекционные заболевания (мононуклеоз, малярия,
микоплазменная пневмония, активный туберкулёз, скарлатина,
бруцеллёз, лептоспироз, корь, эпидемический паротит,
венерическая лимфогранулёма, ветряная оспа, трипаносомоз,
проказа, хламидиоз);
- беременность (редко);
- старческий возраст (около 10% людей в возрасте старше 70 лет
могут иметь ложноположительную МР);
- хронический лимфоцитарный тиреоидит, гемобластозы;
- приём некоторых гипотензивных средств;
- наследственная или индивидуальная особенность.

17. Непрямые методы. Нетрепонемные тесты.

Достоинства нетрепонемных тестов:
простота выполнения;
минимальное время ожидания результата;
высокая чувствительность.
Главные недостатки:
невозможность использования цельной крови;
необходимость ротатора или микроскопа;
возможность ложноположительных результатов.

18. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ);
Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ);
Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИП);
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА);
Иммуноферментный анализ (ИФА);
Метод иммуноблоттинга;
Полимеразная цепная реакция.

19. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

РИФ
Принцип РИФ основан на выявлении флюоресцирующих
антител, так как меченные флюорохромом антитела не теряют
способности соединяться с соответствующим антигеном и тем
самым обусловливают свечение препаратов в сине-фиолетовых
лучах, источником которых является ртутно-кварцевая лампа.
Модификации:
- РИФ-10;
- РИФ-200;
- РИФ-абс.

20. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

РИБТ
Сущность реакции заключается в потере подвижности
бледными трепонемами в присутствии иммобилизинов
испытуемой сыворотки и активного комплемента. Реакция
ставится в условиях анаэробиоза. Техника выполнения самой
реакции довольно сложна, поэтому она ставится в специальных
лабораториях.
Иммобилизины появляются в сыворотке крови больных
позднее, чем другие антитела, и, следовательно, РИБТ
становится положительной позже, чем стандартные
серореакции и РИФ.

21. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

РИП
Основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы,
сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в
присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к
поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются
с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

22. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

РПГА
Основана на феномене агглютинации эритроцитов, на
поверхности которых адсорбированы антигены T. pallidum
(реагент РПГА). При добавлении сыворотки больных
сифилисом, содержащей специфические антитела к спирохете,
к реагенту РПГА происходит агглютинация (склеивание) и
выпадение в осадок эритроцитов. Степень агглютинации
зависит от концентрации антител в сыворотке, поэтому РПГА
позволяет не только выявить присутствие антител, но и
определить их количество.

23. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

24. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

Ложноположительные результаты РПГА наблюдаются в 0,05-2,5 %
случаев и чаще всего обусловлены следующими состояниями:
наличием в сыворотке пациента аутоантител (при системных
заболеваниях соединительной ткани, например при системной
красной волчанке),
антител к другим возбудителям, схожим по антигенной структуре
с T. pallidum (сапрофитные трепонемы полости рта и гениталий),
другими физиологическими и патологическими состояниями
(беременность, онкологические заболевания, острый инфаркт
миокарда).

25. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

ИФА
Широко используется для диагностики сифилиса. Принцип
реакции заключается в соединении сифилитического антигена,
сорбированного на поверхности твердофазного носителя, с
антителом испытуемой сыворотки крови и выявления
специфического комплекса антиген - антитело с помощью
антивидовой иммунной сыворотки, меченной ферментом.
Взаимодействие фермента с субстратом дает цветную реакцию,
интенсивность которой зависит от количества связанных
сывороточных антител.

26. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

27. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

ПЦР
Метод заключается в многократном увеличении (амплификации)
количества ДНК выявляемого микроорганизма. Разработка
вариантов ПЦР для диагностики сифилиса обусловлена
недостаточностью стандартных тестов при раннем
серонегативном, врожденном сифилисе и нейросифилисе. ПЦР
является превосходным методом для диагностики сифилиса при
небольшом количестве трепонем в исследуемом материале.
Остается невыясненным вопрос - отражает ли наличие
трепонемной ДНК присутствие жизнеспособных трепонем или
это могут быть остатки погибших микроорганизмов, содержащие
способную к амплификации ДНК.

28. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

Тест-полоски для быстрого определения сифилиса
Этот метод представляет собой качественный
иммунохроматографический тест для определения АТ к ТР (IgM
и IgG) в цельной крови, сыворотке или плазме.

29. Непрямые методы. Трепонемные тесты.

30. Гонорея.

- инфекционное заболевание, вызываемое гонококками рода
нейссерий и передающееся половым путем.
Возбудитель:
- диплококк бобовидной формы;
- длина – 1.25 - 1.6 мкм;
- ширина – 0.7-0.9 мкм.
В сканирующем электронном микроскопе гонококки имеют вид
шаровидных или диплококковых образований со слегка
бугристой поверхностью. При изучении ультратонких срезов у
гонококков удается выявить клеточную стенку,
цитоплазматическую мембрану, цитоплазму с многочисленными
рибосомами, мезосомы, нуклеоид с нитями ДНК.

31.

32. Лабораторная диагностика гонореи.

1.
Бактериоскопический метод с обязательным окрашиванием
метиленовой синью и по Граму.
Исследуемый материал: отделяемое из уретры, с шейки
матки, из прямой кишки, ротоглотки, с конъюнктивы и др.
Отделяемое наносят тонким слоем на предметное стекло,
высушивают, фиксируют с помощью этанола, затем
производят окраску 1% раствором метиленовой сини и по
Граму.
Определяющий дифференциально-диагностический признак
получают при окраске по Граму: при кратковременном
выдерживании в обесцвечивающем растворе (смесь
этилового спирта с ацетоном) окрашенные кристаллвиолетом
гонококки отдают фиолетовый краситель и докрашиваются
красным красителем (сафранином).

33. Лабораторная диагностика гонореи.

34. Лабораторная диагностика гонореи.

35. Лабораторная диагностика гонореи.

2. Бактериологический метод.
Показаниями к проведению являются неоднократное
получение отрицательного результата бактериоскопического
анализа при клиническом, эпидемиологическом и
анамнестическом подозрении на гонорею, наличие в мазках
из патологического материала подозрительных
на гонококк микроорганизмов, установление
излеченности гонореи.
С целью выделения чистой культуры гонококка используют
следующие среды:
- мясопептонный агар ;
- желточная среда ферментации ЦНИКВИ.

36. Лабораторная диагностика гонореи.

Гонококки на искусственных
питательных средах дают рост в
виде мелких, круглых, блестящих,
слегка выпуклых, гладких
росовидных, бесцветных или
слегка желтоватых колоний
(диаметр около 1 мм) с ровными
краями.

37. Лабораторная диагностика гонореи.

3. Иммунофлюоресцентный метод.
При помощи этого метода вполне удовлетворительно можно
распознать гонококк. Хорошие результаты получают
при прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), когда
фиксированные над пламенем спиртовки препараты
предварительно окрашивают 1%-ным спиртовым раствором
эозина и метиленового синего, а затем обрабатывают
флюоресцирующей антисывороткой. При таком методе
получается более характерное свечение, позволяющее
отличать гонококки от других микроорганизмов.

38. Лабораторная диагностика гонореи.

4. Иммуноферментный анализ.
Используется метод определения АГ с помощью ИФА путем
исследования мазков из уретры и проб мочи.
Метод ИФА является дополнительным быстрым
диагностическим методом для обнаружения Neisseria
gonorrhoeae, особенно при неинвазивном (пробы мочи)
обследовании мужчин.
5. Молекулярно-биологические методы - ПЦР (полимеразная
цепная реакция). Разрешающая чувствительность
обнаружения гонококков в уретральных образцах и моче у
мужчин составляет 98,6% и 94,2% соответственно.
Разрешающая чувствительность обнаружения гонококков в
моче и эндоцервикальных образцах женщин
методом ПЦР составляет 88,9% и 95,2% соответственно.

39. Лабораторная диагностика гонореи.

Методы провокации при гонорее:
- химический (у мужчин инстилляция в уретру 0,25-0,5%
раствора нитрата серебра, у женщин - смазывание уретры 1-2%,
канала шейки матки 2-5% раствором нитрата серебра или
раствором Люголя на глицерине;
- механический метод - у мужчин включает бужирование
прямым бужем уретры на 10 мин или переднюю уретроскопию;
- биологический включает внутримышечное введение
гоновакцины или пирогенала.
- алиментарный - употребление соленой, острой пищи,
- термический - прогревание половых органов
индуктотермическим током.
- для женщин существует физиологический метод - взятие
мазков во время менструации.

40. Урогенитальный трихомониаз.

- широко распространенное
инфекционное воспалительное
заболевание, передаваемое
преимущественно половым путем,
вызывается простейшими
Trichomonas vaginalis.
Этиология. Заболевание вызывает
урогенитальная трихомонада
Trichomonas vaginalis. Это
одноклеточный микроорганизм,
относящийся к простейшим класса
жгутиковых, длиной 13 – 18 мкм (до
30 – 40 мкм). Благодаря движениям
жгутиков и мембраны трихомонады
могут активно перемещаться, а
высокая пластичность тела
позволяет им образовывать
псевдоподии и проникать в
межклеточные пространства.

41. Лабораторная диагностика трихомониаза.

1. Исследование нативного препарата: позволяет наблюдать
движения трихомонад на фоне неподвижных лейкоцитов и
эпителиальных клеток. В нативных препаратах влагалищная
трихомонада определяется по грушевидной или овальной
форме тела величиной немного больше лейкоцита,
характерным толчкообразным движениям и жгутикам, которые
особенно хорошо видны при исследовании в
фазовоконтрастном микроскопе;

42.

43. Лабораторная диагностика трихомониаза.

2. Исследование препарата, окрашенного 1% раствором
метиленового синего или бриллиантового зеленого и по Граму
(последняя окраска позволяет одновременно
идентифицировать Т. vaginalis и гонококки). Преимуществом
исследования трихомонад в окрашенных препаратах является
возможность их исследования спустя длительное время после
взятия материала. В препаратах, окрашенных метиленовым
синим или по Граму, трихомонады имеют овальную, круглую или
грушевидную форму с хорошо выраженными контурами и
нежно-ячеистым строением цитоплазмы. Для выявления более
тонкого строения трихомонад применяют более сложные
методики окраски препаратов (по Романовскому-Гимзе,
Гейденгайну, Лейшману и др.), которые позволяют
рассматривать жгутики, ундулирующую мембрану;

44.

45. Лабораторная диагностика трихомониаза.

3. Люминесцентная микроскопия: основана на свечении объекта в
ультрафиолетовых лучах в темном поле. При незначительной
собственной люминесценции материала применяют
люминофоры: акридиновый оранжевый.
4. Культуральное исследование: при отрицательных результатах
непосредственного исследования патологического материала
трихомонады могут быть обнаружены с помощью
культивирования отделяемого из влагалища, уретры, секрета
простаты или спермы. Данный метод имеет большую ценность
при распознавании атипичных форм, при диагностике
трихомониаза у мужчин и при контроле над результатами
лечения;

46. Лабораторная диагностика трихомониаза.

5. Иммунологические методы неоднократно предлагались для
диагностики трихомониаза, однако они не дают
удовлетворительных результатов. С помощью РСК, РПГА, РИФ
в сыворотке крови больных и секретах половых органов
выявляются различные антитела. Однако серологические
реакции не могут быть использованы в качестве основного
диагностического теста, так как у части больных они
отрицательны, иногда позитивны после
излечения трихомониаза и ложноположительны у
неболевших трихомониазом. В некоторых случаях допустимо их
применение в качестве отборочного теста, особенно у женщин;
6. Метод латекс-агглютинации выявляет растворимые АГ в
концентрации 50 нг/мл, что обуславливает его чувствительность
(98%) и специфичность (99,8%). Метод полезен для выявления
хронического трихомониаза и бессимптомного носительства;
7. ПЦР.

47. Урогенитальный хламидиоз.

- одно из наиболее распространенных заболеваний,
передаваемых половым путем, вызываемое микроорганизмом
Chlamydia trachomatis.
Этиология: грамотрицательная бактерия с уникальным жизненным
циклом. Этот микроорганизм занимает как бы промежуточное
положение между бактериями и вирусами и сочетает в себе их
основные характеристики:
имеет обе нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК);
имеет клеточную стенку;
способна к бинарному делению;
чувствительна к антибиотикам;
не способна функционировать вне клеток хозяина;
не может расти на искусственных питательных средах;
по размерам соизмерима с вирусами.

48. Урогенитальный хламидиоз.

Жизненный цикл хламидии
состоит в переходе одной
формы в другую внутри
клеток хозяев. Различают
две формы существования
хламидий:
- элементарное тельце (ЭТ) –
диаметр около 300 нм и
метаболически неактивно;
- ретикулярнопе тельце (РТ) –
диаметр в три раза больше,
чем ЭТ, не заразны, но
метаболически активны и
способны к бинарному
делению.

49.

50.

51. Лабораторная диагностика хламидиоза.

1. Бактериоскопический метод.
Предполагает выявление хламидий, их морфологических
структур и антигенов в пораженных клетках (клиническом
материале).
Материалом для исследования служат соскобные препараты с
доступных исследованию слизистых оболочек мочеполовых
(уретра, шейка матки и т.п.).
Из исследуемого материала готовят мазки, которые окрашивают
по Романовскому-Гимзе. Цитоплазматические включения
хламидий (тельца Гальберштедтера-Провачека) содержат или
крупные ретикулярные тельца, или мелкие элементарные
тельца. Они по цвету и внутренней структуре отличаются от
ядра клетки и цитоплазмы. Метод характеризуется
сравнительно низкой чувствительностью, позволяет
диагностировать от 10 - 20% случаев урогенитальной инфекции.

52.

53. Лабораторная диагностика хламидиоза.

2. Люминесцентная микроскопия.
Применение люминесцирующих
антител для выявления
антигенов хламидий в
цитоплазматических включениях
в соскобных препаратах
урогенитального тракта
значительно увеличивает
чувствительность и
специфичность метода. При
люминесцентной микроскопии
антигены хламидий выявляют на
красном или оранжевом фоне
цитоплазмы эпителиальных
клеток в виде внутриклеточных
включений ярко-зеленого цвета.

54. Лабораторная диагностика хламидиоза.

3.
Бактериологический метод.
Основан на выделении хламидий из исследуемого материала
путем заражения куриных эмбрионов или клеточных культур с
последующей идентификацией возбудителя. Исследуемый
материал тот же, что и при бактериоскопическом методе. Для
удаления сопутствующей бактериальной флоры клинический
материал помещается в специальные транспортные среды,
содержащие антибиотики, не влияющие на жизнеспособность
хламидий. Способ может быть использован в течение всего
периода заболевания. Особенно эффективен при острых
формах, на ранних этапах инфекции до начала
антибиотикотерапии.

55. Лабораторная диагностика хламидиоза.

4. Серологические методы диагностики.
Основаны на выявлении специфических антител в сыворотке
крови, а также в секретах больных и переболевших. Для
серодиагностики обычно используют реакцию связывания
комплемента (РСК), непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) и
реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА). Интерпретацию
результатов серологического обследования следует проводить в
совокупности с анализом клинико-эпидемиологических данных,
а также с учетом особенностей использованного
серологического теста. Оптимальным является параллельное
применение нескольких серологических реакций. Эти
серологические тесты могут быть также использованы для
проведения эпиднадзора за хламидиозами.
5. ИФА.
6. ПЦР.

56. Урогенитальный кандидоз.

- заболевание мочеполовой системы, вызванное
дрожжеподобными грибами рода Candida.
Этиология: возбудитель относится к несовершенным грибам —
дейтеромицетам (анаскоспоровым). Дрожжеподобные грибы
вида C.albicans одноклеточные микроорганизмы овальной или
круглой формы. Образуют псевдомицелий (нити из удлинённых
клеток), бластоспоры (клетки почки, сидящие на перетяжках
псевдомицелия) и некоторые хламидоспоры — споры с двойной
оболочкой.
Главными признаками, отличающими грибы рода Candida от
истинных дрожжей являются следующие:
- наличие псевдомицелия
- отсутствие аскоспор (спор в сумках внутри клеток)
- характерные культуральные особенности

57. Лабораторная диагностика кандидоза.

1. Микроскопия нативных препаратов.

58. Лабораторная диагностика кандидоза.

2. Микроскопия окрашенных препаратов ( по Граму, Цилю –
Нильсену, Романовскому – Гимзе, метиленовым синим)

59. Лабораторная диагностика кандидоза.

3. Культуральный метод: посев
материала на среду Сабуро,
сусло-агар или
мясопептонный бульон.
4. ПИФ;
5. ИФА;
6. ПЦР.

60. Спасибо за внимание.