Иммунологические методы исследования в ветеринарии

1.

Факультет ветеринарной
медицины
КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ,
ЭПИЗООТОЛОГИИ И
ВИРУСОЛОГИИ
Ведущий преподаватель доктор
биологических наук, профессор
Нино Нодариевна Гугушвили

2. Лабораторные занятия по иммунологии для факультета ветеринарной медицины

Факультет ветеринарной
медицины
Лабораторные занятия
по иммунологии
для факультета
ветеринарной медицины

3. Дисциплина:

Факультет ветеринарной
медицины
Дисциплина:
Иммунология

4.

Факультет ветеринарной
медицины
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ
В настоящее время иммунология эмбриогенеза выделилась в
отдельную отрасль науки - иммунологию репродукции.
Изучение иммунного статуса организма животных на всех
стадиях репродуктивного цикла является одной из актуальных
тем. Оплодотворение, органогенез, иммунологическая защита
плода, возникновение родовой деятельности, лактация,
передача иммунитета от матери к плоду, бесплодие,
самопроизвольное
прерывание
беременности,
преждевременные роды в той или иной степени обусловлены
влиянием иммунобиологических механизмов.

5.

Факультет ветеринарной
медицины
СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ
ИММУННОЙ СИСТЕМЕ
Под термином иммунитет понимается способ защиты организма от живых
тел и веществ, несущих на себе признаки генетической чужеродности. В
понятие живых тел и веществ, несущих на себе признаки чужеродного
генома, могут быть включены бактерии, вирусы, простейшие, черви, белки,
клетки, ткани, измененные аутоантигены. Приведенная формулировка
иммунитета находится в полном соответствии с "аксиомой Бернета",
постулирующей, что центральным биологическим механизмом иммунитета
служит распознавание "своего" и "чужого".

6.

Факультет ветеринарной
медицины
Способность организма развивать высокоспецифическую
ответную реакцию на чужеродные молекулы называется
иммунологической реактивностью. Иммунологическая
реактивность проявляется иммунным ответом, под которым
подразумеваются определенные изменения в организме,
развивающиеся после попадания в него агента и
заканчивающиеся
накоплением
сенсибилизированных
эффекторных клеток или антител. За осуществление
иммунного ответа - ответственна лимфоидная ткань.
Совокупность всех лимфоидных органов и скоплений
лимфоидных клеток тела составляет иммунную систему
организма.

7.

Факультет ветеринарной
медицины
В иммунной системе различают центральные органы (вилочковая железа,
сумка Фабрициуса у птиц, пейеровы бляшки, костный мозг) и
периферические (лимфатические узлы, селезенка, кровь). Выработка
антител и накопление сенсибилизированных лимфоцитов происходит в
периферических органах, развитие и функционирование которых находится
под непосредственным влиянием центральных.
Иммунная система организма животных и человека состоит из трех
самостоятельно развивающихся, но совместно функционирующих
клеточных компонентов – Т- лимфоцитов,
В- лимфоцитов и макрофагов. Т- клеточный компонент иммунитета в
своем развитии и функционировании зависит от тимуса и носит название
тимусзависимого. Тимусзависимая система реализует иммунный ответ
клеточного типа с накоплением клеток эффекторов и ответственна за
развитие
реакций
гиперчувствительности
замедленного
типа,
трансплантационного и противоопухолевого иммунитета, других реакций,
в которых эффектором выступает сенсибилизированный Т- лимфоциткиллер.

8.

Факультет ветеринарной
медицины
В- компонент иммунитета не зависит от тимуса и осуществляет
гуморальный иммунный ответ. В- лимфоцит после взаимодействия с Тлимфоцитом и макрофагом трансформируется в плазматическую
клетку, активно продуцирующую иммуноглобулины определенного
класса. Макрофаги являются основными клетками, подающими
антигенный стимул Т- и В- лимфоцитам.
Достижения иммунологии последних десятилетий позволили
выделить среди лимфоцитов их субпопуляции. Среди Т- лимфоцитов
различают: Т- эффекторы (killer) - осуществляют клеточные формы
иммунного ответа реакцию гиперчувствительности замедленного
типа, отторжение трансплантанта, специфический лизис клеток
мишеней, противоопухолевый и противовирусный иммунитет и
некоторые другие феномены.

9.

Факультет ветеринарной
медицины
Т- помощники (helper) - включают В- лимфоцит в пролиферацию и
дифференцировку, обеспечивают накопление соответствующего клона зрелых
антителопродуцентов - плазматических клеток, синтезирующих антитела против
иммунизирующего агента.
Т- супрессоры (suppressor) - тормозят включение В- лимфоцитов в пролиферацию и дифференцировку, ингибируют выработку антител и развитие реакций
гипер-чувствительности
замедленного
типа,
определяют
феномен
иммунологической толерантности.
Т- усилители (amplifier) - разновидность Т- хелперов - усиливают функцию
Т- эффекторов, Т- супрессоров и других клеток.
Т- дифференцирующиеся лимфоциты, взаимодействуют с кроветворными
стволовыми клетками и оказывают влияние на их миграцию, пролиферацию и
дифференцировку.
Среди В- лимфоцитов выделяют предшественники
иммуноглобулинов различных классов -А, М, G.
иммунопродуцентов

10.

Факультет ветеринарной
медицины
Иммуноглобулин А (Ig A) – встречается в моно-, ди– и полимерной форме в
сыворотке крови, секреторных жидкостях, а также на поверхности
слизистой оболочки. Образуется при антигенном раздражении.
Синтезируется плазматическими клетками скоплений лимфоидной ткани
под слизистой оболочкой, а также в селезенке и лимфатических узлах и
играет роль в обеспечении местной защиты от вирусных инфекций. Ig A
может активировать комплемент альтернативным путем.
Иммуноглобулин G (Ig G) - единственный из иммуноглобулинов, который
проходит через плаценту и обеспечивает защиту от инфекционных болезней
в первые недели жизни. В основном образуется при повторной
иммунизации.
Иммуноглобулин M (Ig M) располагается по поверхности клетки и
выполняет функцию рецептора. Низкоактивные, появляются первыми после
антигенного раздражения.

11.

Факультет ветеринарной
медицины
В- супрессоры – (относятся к пре В- клеткам,) тормозят синтез ДНК и
пролиферацию предшественников антителопродуцентов, регулируют
пролиферацию клеток предшественников в костном мозге. Основная их
роль – угнетение антителогенеза на территории костного мозга.
Нулевые клетки - лимфоциты, не несущие отличительных маркеров Т- или
В- лимфоцитов или имеющие очень низкую плотность соответствующих
структур на своей поверхности. Они способны осуществлять
антителозависимый, не требующий присутствия комплемента, лизис
клеток-мишеней, т.е. разрушение аутологичных, аллогенных или
ксеногенных клеток в присутствии специфичных антител.
L- и К- лимфоциты - разновидности нулевых лимфоцитов, также способны
осуществлять антителозависимый не требующий присутствия комплемента
лизис клеток-мишеней.

12.

Факультет ветеринарной
медицины
NK- клетки (Natural killer cells) - естественные клетки киллеры. Они
осуществляют независимый от антител и комплемента лизис клетокмишеней. Наиболее распространенным мнением является то, что
физиологическая роль естественных клеток киллеров заключается, прежде
всего, в элиминации вирусинфицированных клеток, в противоопухолевой
защите организма, а также в контроле за процессами пролиферации и
дифференцировки соматических клеток.
Т- лимфоцит после взаимодействия с макрофагом включает В- лимфоцит
в антителогенез. Т- хелперы и Т- супрессоры выступают в качестве
главных регуляторов иммунной системы на клеточном уровне. Три типа
зрелых Т- лимфоцитов, три типа зрелых В- лимфоцитов и макрофаги основные
клеточные
партнеры,
осуществляющие
всю
гамму
высокоспецифических ответных реакций организма животных.

13.

Факультет ветеринарной
медицины
Для иммунологического распознавания и взаимодействия клеток в иммунном ответе важное
значение
имеют
антигены,
контролируемые
главной
генетической
системой
гистосовместимости (HLA). Понятие о главной системе гистосовместимости возникло в 40-е
годы, когда были установлены генетические законы совместимости тканей и обоснованно
наличием группы тесно сцепленных генов, различия которых обуславливают наиболее резкую
несовместимость тканей при пересадках и наиболее выраженные реакции отторжения. В
пределах главного комплекса гистосовместимости локализованы не только гены,
контролирующие главные трансплантационные антигены, но и гены, определявшие высоту
иммунного ответа на тот или другой конкретный антиген. Эта же система ответственна и за
синтез поверхностных структур иммуноцитов, обеспечивающих их взаимодействие.
Регуляция иммунного ответа осуществляется на трех уровнях: (внутриклеточный, клеточный,
органный уровень). Внутриклеточный уровень регуляции опосредован генной информацией,
заложенной в ДНК каждой клетки, которая представлена генами главного комплекса
гистосовместимости и генетическим аппаратом кодирования синтеза молекул
иммуноглобулинов и рецепторных структур лимфоцитов. Клеточный уровень регуляции
иммунного ответа обусловлен гетерогенностью лимфоидных клеток, присутствием в их
популяции киллерных, хелперных и супрессорных субъединиц. Наличие в иммунной системе
центральных и периферических органов свидетельствует о том, что имеется регуляция
иммунного ответа и на органном уровне.

14.

Факультет ветеринарной
медицины
1.КОМПЛЕКС ТЕСТОВ 1 УРОВНЯ
Выявление как первичных, так и вторичных иммунодефицитных состояний (ИДС)
среди животных имеет важное значение в ветеринарной практике.
Оценку иммунного статуса организма животных можно осуществить с помощью
тестов I и II уровня. По тестам I уровня (общее число лейкоцитов, фагоцитоз,
уровень Т- и В- лимфоцитов, сывороточные иммуноглобулины классов -А, М, G)
можно выявить “грубые” поломки и дефекты в иммунитете.
1.1. Взятие крови из ярёмной вены в объеме 10-15 мл. Кровь в объеме 5 мл
переносят в центрифужную пробирку, добавляют 2,7 % ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), и несколько раз встряхивают. С момента
взятия до начала анализа кровь может храниться 2-3 часа при комнатной
температуре.

15.

Факультет ветеринарной
медицины
1.2. Морфологическая картина крови
1.2.1. Подсчет лейкоцитов
В пробирки Флоринского или в лунки полистироловых пластин разливают по 0,4 мл
жидкости Тюрка. Состав жидкости Тюрка следующий: ледяная уксусная кислота 1-3
мл, 1%-ный водный раствор метиленового синего или генцианвиолета и
дистиллированная вода до 100 мл.
Стеклянным капилляром набирают предварительно перемешанную кровь до
метки 0,02 мл (20 мм 3). Наружную поверхность капилляра вытирают от крови и
плавно выдувают содержимое на дно пробирки (лунки) с жидкостью Тюрка.
Несколько раз капилляр промывают, насасывая и выдувая содержимое
пробирки (лунки) и вносят в сеточную камеру Горяева при помощи глазной
пипетки. Выждав 1-2 минуты, пока клетки осядут, их подсчитывают под
микроскопом при увеличении 10 10 или 10 20. Клетки подсчитывают в 25
больших квадратах (разделенных на 16 малых), начиная с левого верхнего угла
сетки и далее сверху вниз (итого в пяти вертикальных рядах - по пять в ряду). В
каждом квадрате считают клетки, находящиеся внутри, а также лежащие на
левых и нижних линиях и в левых углах квадрата.
Для подсчета содержания лейкоцитов в 1 мкл крови число подсчитанных в 25-ти
квадратах клеток умножают на 200.

16.

Факультет ветеринарной
медицины
1.2.2. Определение лейкограммы
Готовят мазок и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Готовую краску
предварительно разводят дистиллированной водой из расчета 1 мл на 2-3
капли краски. Полученную смесь наливают на мазок, держат 30-40 минут (в
зависимости от температуры воздуха и активности краски), после чего ее
смывают дистиллированной водой, препарат высушивают. Окрашенный
мазок будет розовато-фиолетового цвета. Также мазки можно окрасить по
Паппенгейму - Крюкову и Май - Грюнвальду.
Мазки крови микроскопируют под увеличением 90х15 с
использованием иммерсионной системы.
Мазок условно делят на 4 участка и, отступив от края мазка на 3-4 поля
зрения, внимательно просматривают его зигзагообразно, то есть 3-5 полей вдоль края мазка, затем 3-5 полей - под прямым углом к середине, далее 3-5
полей параллельно краю мазка и снова под прямым углом возвращаются к
краю мазка. В таком порядке микроскопируют каждый из условно
разделенных участков. Для подсчета лейкоцитов пользуются счетчиком,
подсчитывают 100 клеток.

17.

Факультет ветеринарной
медицины
1.2.3. Подсчет количества лимфоцитов
Для подсчета в пробе крови относительное содержание лимфоцитов в
( %),
а в
Х
определяется по формуле:
100
где а - количество лейкоцитов в 1 мкл крови; в содержание отдельного вида лейкоцитов, подсчитанных в
мазке крови в (%). Для пересчета количества лейкоцитов по
системе СИ (г/л) полученную цифру умножают на 106.

18.

Факультет ветеринарной
медицины
1.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ Т-, В -, NK-ЛИМФОЦИТОВ В
МАЗКАХ КРОВИ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЖИВОТНЫХ
( по Пирсу, 1962 г., в модификации Гугушвили Н.Н., 2000г.)
Данная методика является экспресс методом для определения неспецифической
эстеразы в клетках крови: Т-, NK- лимфоцитов. Эстеразы входят в подгруппу (3.1).
Механизм их действия на бактерии заключается в их переваривании благодаря
способности гидролизовать белковые субстраты. Эстераза, или эластаза разрушает
пептидогликаны бактериальной стенки. Одновременно в одном препарате можно
определить В - клетки по окраске ядер. Применение методики основано на
взаимодействии неспецифической эстеразы с а- нафтилацетатом. Эстераза
способствует гидролизу α- нафтилацетата с образованием α- нафтола и уксусной
кислоты (первичная реакция), которая создает слабокислую среду. Для
поддержания рН в пределах 8,0 - 8,2 в систему вводят буферную смесь,
предложенную нами, состоящую из КН2РО4 и Na2HРО4, что оказывало влияние на
активность фермента эстеразы (изобретение по заявке № 000344 от10.01.2000г).
Затем а-нафтол взаимодействует с красителем - нейтральным прочным синим В с
образованием комплексного соединения азокрасителя (вторичная реакция).
Образовавшийся комплекс (азокраситель) окрашивает эстеразу содержащуюся
внутри Т-, и NК- лимфоцитов.

19.

Факультет ветеринарной
медицины
Первичная реакция (реакция ферментативного расщепления) гидролиза нафтилацетата с участием фермента эстеразы:
ОСОН3
ОН
Фермент
+ Н2О
-нафтилацетат
+СН3СООН
- нафтол

20.

Факультет ветеринарной
медицины
Вторичная реакция (реакция сочетания) т.е. взаимодействия - нафтола с
нейтральным прочным синим В:

21.

Факультет ветеринарной
медицины
Взятие крови, приготовление и фиксация мазков
Кровь для исследования берут у сельскохозяйственных животных из
яремной вены, из которой готовят мазок. Для этого каплю, крови наносят
на край сухого обезжиренного стекла, которое удерживают между
большим и средним пальцами левой руки. Впереди капли под углом 45°
подводят шлифованный край покровного стекла так, чтобы
образовавшийся угол между стеклами был равномерно заполнен кровью.
Движением правой руки от себя каплю распределяют тонким слоем по
поверхности предметного стекла без просветов, в виде равномерной
полоски, не выходящей за ее края. Мазки сушат на воздухе и фиксируют в
парах 40 % раствора формалина в течение 5 минут.

22.

Факультет ветеринарной
медицины
Приготовление буферных растворов
В состав буферной смеси входят: раствор А и Б в соотношении 1:20.
Приготовление раствора А
Для приготовления раствора А берут 0,34 г КН2РО4 (однозамещенного
фосфорнокислого калия) и растворяют в небольшом количестве
дистиллированной воды затем в мерной колбе объемом 25 мл доводят до метки.
Приготовление раствора Б
Берут 8,9 г Na2HPO4, (двузамещенного фосфорнокислого натрия) и растворяют
в небольшом количестве дистиллированной воды и в мерной колбе объемом
500 мл доводят до метки.
Для лучшей диффузии растворы А и Б оставляют на сутки в темном месте.
Тщательно перемешивают 25 мл раствора А и 475 мл раствора Б, оставляют на
сутки и затем измеряют рН буферного раствора. При этом необходимо получить
рН от 8,0 до 8,2.

23.

Факультет ветеринарной
медицины
Приготовление инкубационной смеси
Правильное
приготовление
инкубационной
смеси
имеет
немаловажное значение для дальнейшей окраски мазков. Готовят
раствор 1 и 2.
Приготовление раствора 1
2,5 мг - нафтилацетата растворяют в 0,125 мл ацетона
разбавленного таким же количеством дистиллированной воды,
добавляя небольшими порциями. После растворения к нему
постепенно добавляют 6,25 мл дистиллированной воды.
Приготовление раствора 2
6,25 мг нейтрального прочного синего растворяют в 6,25 мл
дистиллированной воды, смешивая их постепенно. Для
поддержания рН добавляют 0,125 мл буферного раствора с рН = 8,08,2.
Полученные растворы 1 и 2 смешивают, фильтруют в темной
комнате через стеклянный фильтр.

24.

Факультет ветеринарной
медицины
Инкубация мазков
Инкубацию мазков проводят в темной комнате в течение 2-х часов. На
фиксированные
формалином
мазки
наносят
равномерным
слоем
инкубационную смесь. Периодически добавляют инкубационную смесь, т.к.
происходит испарение жидкости, которая включает в себя легко
улетучивающиеся вещества (ацетон, нафтилацетат). После инкубации мазки
промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
Для дифференцировки лимфоцитов от других клеток крови в дальнейшем
окрашивают ядра клеток (0,5 - 1 минуту) 0,25 % водным раствором Азуром-II,
или
0,5% нейтральным красным приготовленным на физиологическом
растворе. Затем краску сливают, промывают дистиллированной водой, мазки
высушивают на воздухе в темной комнате.
Микроскопия мазков
Микроскопию проводят при увеличении (90×15) с использованием
иммерсионной системы. При этом Т- лимфоциты содержат одну или несколько
гранул темного цвета расположенных по периферии клетки, ядра хорошо
выражены; в NK- клетках ядра хорошо выражены, а цитоплазма окрашена
диффузно в серый цвет. В- лимфоциты имеют хорошо выраженные ядра, со
слабо окрашенной цитоплазмой, клетки гранул не содержат (рис.1).

25.

Факультет ветеринарной
медицины
1.4. Постановка реакций розеткообразования
1.4.1. Выделение лейкоцитарной взвеси для постановки
реакции розеткообразования
Для этого проводят лизис эритроцитов гипотоническими
растворами (гемолитической жидкостью) следующего состава:
0,083 % NH4C1 + 0,04 г/л ЭДТА, рН 7,2 - 7,5 доводится 1 % Na2CO3
Ход исследования
К 0,5 мл крови, взятую с ЭДТА (1:9) добавляют 1 мл
гемолитической жидкости и перемешивают в течение 30 сек.,
быстро добавляют 2-5 мл забуференного физиологичекого раствора
(ЗФР), для предотвращения разрушения лейкоцитов. Затем
центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об/мин. Из
центрифугата надосадочную жидкость удаляют, и к осадку
добавляют 1-2 мл гемолитической жидкости, встряхивают
пробирку в течение 3 - 5 сек. Затем добавляют 10 мл ЗФР и
центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Надосадочную
жидкость удаляют, к осадку лейковзвеси добавляют
0,4-0,5
мл ЗФР и ресуспендируют. Готовят рабочую концетрацию

26.

Факультет ветеринарной
медицины
1.4.2. Постановка реакции розеткообразования для определения Тлимфоцитов - Е-розеткообразование. (Р. В. Петров и соавт., 1992 г.)
Для идентификации Т- лимфоцитов крупного рогатого скота используется
способность Т- клеточного антигена (CD3) взаимодействовать с эритроцитами
барана (ЭБ). Эта возможность реализуется с помощью обычной реакции
розеткообразования.
Для проведения данной реакции в лунку круглодонного планшета вносят 50
мкл исследуемой клеточной суспензии и 50 мкл 0,5 % суспензии ЭБ,
приготовленной на ЗФР. Планшет центрифугируют в течение 5 минут при 1500
об/мин после чего ставят в холодильник (4°С) на 30 минут. Не удаляя
надосадочную жидкость, осторожно вносят в лунку 50 мкл 1% глутарового
альдегида приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и
выдерживают при комнатной температуре 5-7 минут. Надосадочную жидкость
из лунок удаляют путем встряхивания с планшета. В лунки к осадку добавляют
100 мкл ЗФР. Осадок тщательно ресуспендируют. На обычных предметных
стеклах готовят препарат-каплю, которую высушивают при комнатной
температуре и фиксируют 10 минут в метаноле, затем окрашивают по
Романовскому - Гимзе в разведении 1 : 5 в течение 5 минут.

27.

Факультет ветеринарной
медицины
Учет результатов: Т- лимфоциты хорошо просматриваются в обычном
световом микроскопе при увеличении 7 90. Подсчитывают 100 - 200
лимфоцитов и считают число лимфоцитов, присоединивших три
эритроцита и более. Исходя из числа лейкоцитов и лимфоцитов (в
морфологии и процент количества Е- РОЛ в Тл), определяют
абсолютное число Т- клеток в 1 мкл.
Абсол. кол во
лимфоцитов в
Абсол. кол во Тл
морфологии
L %
Абсол. кол во
лимфоцитов (из
100
морфологии )
лимфоцитов % Тл
100

28.

Факультет ветеринарной
медицины
1.5. Постановка реакции розеткообразования для определения
В - лимфоцитов
Для определения В- лимфоцитов с помощью розеткообразования применяют
реакцию ЕАС- розеткообразование, которая основана на присутствии рецептора для
три компонента комплемента (Сз) на поверхности В– клеток.
Белки системы комплемента, относятся к факторам неспецифической защиты и
одновременно, участвуют в реакциях специфического иммунного реагирования
(иммунный лизис клеток мишеней). Т.к. В– клетки не имеют рецепторов к
эритроцитам барана или быка, поэтому непосредственное взаимодействие таких
эритроцитов с В- лимфоцитами невозможно. Для того, чтобы присоединение
эритроцитов к В- лимфоцитам состоялось, т.е. образовалась розетка, необходимо
посредничество комплемента и антиэритроцитарных антител. С этой целью
эритроциты
обрабатывают
гемолитической
сывороткой,
содержащей
антиэритроцитарные антитела, при этом создается комплекс антиген - антитело, с
которым и связывается комплемент. Все В- лимфоциты имеют рецепторы к Сз
компоненту комплемента и по розеткообразованию, т.е. по количеству лимфоцитов,
присоединивших комплекс эритроцит - антитело - комплемент (ЕАС), можно судить
о количестве В- лимфоцитов. Розеткообразующей клеткой ЕАС - РОК считается
лимфоцит, к которому присоединились три и более ЕАС- комплекса.

29.

Факультет ветеринарной
медицины
1.5.1. Определение В-лимфоцитов с помощью ЕАС розеткообразования
(Гущин И.С. и соавторы 1981 г.)
Для определения В - лимфоцитов в реакции ЕАС розеткообразования необходимо приготовление диагностикума,
получаемого при иммунизации чужеродными эритроцитами (ЭБ)
и инкубации последних с иммунными сыворотками в присутствии
комплемента.
1.5.2. Приготовление взвеси эритроцитов быка
Из хорошо отмытых эритроцитов быка готовят 5 мл 2,5 % взвеси и
добавляют к нему 1,25 мл 0,5 % раствора глутарового альдегида.
Раствор хорошо размешивают и помещают на 20 минут в
термостат при 37°С. Фиксированные эритроциты осаждают
центрифугированием и ресуспендируют в 5 мл ЗФР.

30.

Факультет ветеринарной
медицины
1.5.3. Приготовление комплемента
В пробирку смоченную физиологическим раствором вносят 0,5 - 0,8
мл крови мыши и помещают в термостат (37°С) на 20 минут.
Пробирку переносят в холодильник при 4°С на 15 минут, затем
центрифугируют 7-10 минут при 1500 об/мин. К 0,2 мл полученной
сыворотки добавляют 1,8 мл ЗФР.
1.5.4. Получение кроличьей антисыворотки против эритроцитов
быка
В краевую вену уха кролика вводят 20 мл 10 % взвеси эритроцитов
быка тремя инъекциями в течение 16 часов: 10 мл - изначально и по 5
мл через 6 и 16 часов после первой инъекции. На 7-е сутки после
первой инъекции у кролика берут из уха кровь, которую помещают на
30 минут в термостат (37°С). Образовавшийся сгусток обводят для
наступления ретракции и оставляют пробирку на ночь в
холодильнике. Затем сыворотку отбирают, освобождают от примесей
эритроцитов центрифугированием (10 минут при 1500 об/мин.) и
выдерживают в холодильнике сутки. После этого, сыворотку вновь
отсасывают, центрифугируют, прогревают 30 минут на водяной бане
при 56°С (для инактивации комплемента) и определяют титр

31.

Факультет ветеринарной
медицины
1.5.5. Приготовление фиксированной ЕАС- системы
Для этого к 1,6 мл 2,5 % взвеси фиксированных эритроцитов
быка добавляют 1,6 мл сыворотки против эритроцитов быка,
разведённой в соотношении 1:16. Взвесь помещают в
термостат на 45 минут при 37°С и отмывают дважды ЗФР с
последующим центрифугированием (по 10 минут при 1500
об/мин). Полученный осадок ресуспендируют в 1,6 мл ЭФР и
добавляют 1,6 мл сыворотки крови мышей в разведении 1:10
(источник комплемента). Инкубируют 30 минут при 37°С.
Эритроциты дважды отмывают ЗФР и готовят 0,5 % взвесь
сенсибилизированных эритроцитов быка. Полученный
комплекс хранится в холодильнике при 4°С в течение 4
месяцев.

32.

Факультет ветеринарной
медицины
1.5.6. Постановка реакции ЕАС - розеткообразования
В лунку планшета помещают 50 мкл лейкоцитов выделенных при
помощи гемолизирующих растворов (см.1.4.; 1.4.1.) и добавляют 5
мкл ЕАС- комплекса. Инкубируют добавлением 50 мкл 1 % раствора
глутарового альдегида в течение 5 минут при 4°С и центрифугируют
в течение 5 минут при 1500 об/мин. Для фиксации не удаляя
надосадочную жидкость, осторожно добавляют 50 мкл 1 % раствора
глутарового альдегида и выдерживают при комнатной температуре в
течение 5-7 минут. Фиксацию прерывают интенсивным
встряхиванием, удаляя надосадочную жидкость одновременно из
всех лунок планшета. К осадку добавляют 50 мкл ЗФР и хорошо
ресуспендируют, суспензию переносят на предметные стёкла, готовят
препарат – каплю, которую подсушивают, фиксируют 10 минут в
метаноле и окрашивают 5 минут по Романовскому - Гимзе в
концентрации
1:5.
Подсчитывают
количество
лимфоцитов
присоединивших 3 и более эритроцита быка. По количеству
лимфоцитов из морфологии и % ЕАС - РОК рассчитывают по
абсолютному количеству В- лимфоцитов в 1 мкл.

33.

Факультет ветеринарной
медицины
Абсол. кол во
лимфоцитов
Абсол. кол во Вл
L %
лимфоцитов (из
100
Абсол. кол во
морфологии )
лимфоцитов % Вл
100

34.

Факультет ветеринарной
медицины
1.6. Постановка реакций розеткообразования для определения
субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов
Подобно другим клеткам участвующими в иммунном ответе нейтрофильные
гранулоциты представляют собой гетерогенную популяцию. Поэтому в
настоящее время предпринимаются попытки подтвердить факт гетерогенности
нейтрофильных гранулоцитов по функциональным и морфологическим
параметрам. Популяции нейтрофильных гранулоцитов делят по способности Ерозеткообразования
на:
ранние
розеткообразующие
нейтрофильных
гранулоцитов (р. Е - РОН); поздние розеткообра-зующие нейтрофильных
гранулоцитов (п.Е - РОН) и нейтрофильных гранулоцитов несущие Сз рецепторы компоненту комплемента (ЕАС - РОН).
Показано, что увеличение р. Е - РОН, дает возможность оценить степень и
стадию воспалительного процесса на до клиническом уровне, когда еще не
происходит увеличение общего количества лейкоцитов и скорости оседания
эритроцитов (СОЭ). По показателю п.Е - РОН можно определить активность
воспалительного процесса, если уровень п.Е - РОН увеличивается, если же п.Е РОН снижается, то степень дефицита можно оценить по системе
нейтрофильных гранулоцитов, обусловленного нарушением костномозгового
созревания нейтрофильных гранулоцитов (НГ). С помощью определения
количества ЕАС – РОН возможно оценить способность участия нейтрофилов в
цитотоксических реакциях и их участие в иммунном фагоцитозе.

35.

Факультет ветеринарной
медицины
1.6.1. Метод определения р.Е - РОН ( Нестерова И.В., Колесникова Н.В.,
Чудилова Г.А. 1996г.)
В лунку круглодонного планшета вносят 50мкл исследуемой суспензии клеток
полученных методом, описанным в (1.4.; 1.4.1.) и 50 мкл 0,5 % суспензии ЭБ
трижды отмытых ЗФР. Инкубируют в холодильнике (4°С) в течение 5минут и
центрифугируют 5 минут при 1500 об/мин. Не удаляя надосадочную
жидкость, осторожно в лунку вносят 50 мкл 1 % глутарового альдегида и
выдерживают в течение 5-7 минут. Надосадочную жидкость из лунок удаляют
путем встряхивания с планшета. К осадку добавляют
100 мкл ЗФР, хорошо
ресуспендируют и на предметных стеклах готовят препарат - каплю. Препарат
высушивают при комнатной температуре, фиксируют 10 минут в метаноле и
окрашивают 5 минут по Романовскому - Гимзе в разведении 1:5.
Учет результатов: при увеличении (7×90) р. Е - РОН - подсчитывают в
обычном световом микроскопе, на 100-200 нейтрофилов присоединивших 3 и
более эритроцита быка нагруженных антигеном и комплементом. Исходя из
общего числа лейкоцитов; нейтрофилов по количеству НГ- образующих
розетки определяют абсолютное число
р. Е - РОН.

36.

Факультет ветеринарной
медицины
Абс. кол во НГ
Абсол. кол во
в морфологии
р.Е
РОН
Абс. кол во лейкоцитов % НГ
100
Абсол. кол во НГ % НГ
100
(из
(из морфологии )
морфологии )

37.

Факультет ветеринарной
медицины
1.6.2. Метод определение поздних Е-РОН (Нестерова И.В., Колесникова Н.В.,
Чудилова Г.А. 1996г.)
В лунку круглодонного планшета вносят 50 мкл суспензии лейкоцитов и 50 мкл
0,5 % суспензии ЭБ (эритроциты быка) приготовленной на ЗФР. Для инкубации на
20 минут планшет помещают в холодильник при 4°С. Центрифугируют 5 минут
при 1500 об/мин. Повторно инкубируют в холодильнике при температуре 4°С в
течение 60 минут. Не удаляя надосадочную жидкость осторожно вносят в лунку
50мкл 1 % раствора глутарового альдегида и выдерживают при комнатной
температуре 5-7 минут. Надосадочную жидкость из лунок удаляют путем
встряхивания планшета. К осадку добавляют 100 мкл ЗФР, хорошо
ресуспендируют и на предметных стеклах готовят препарат-каплю. Препараты
высушивают при комнатной температуре, фиксируют 10 минут в метаноле и
окрашивают 5 минут по Романовскому - Гимзе в разведении 1:5.
Учет результатов: при увеличении (7×90) п.Е - РОН - подсчитывают в обычном
световом микроскопе, на 100-200 нейтрофилов присоединивших 3 и более
эритроцита быка нагруженных антигеном и комплементом. Исходя из общего
числа лейкоцитов; нейтрофилов по количеству НГ- образующих розетки
определяют абсолютное число п.Е– РОН по следующей формуле:

38.

Факультет ветеринарной
медицины
Абсол. кол во НГ
Абсол. кол во
Абсол. кол во п.Е
РОН
лейкоцитов % НГ
100
(из
морфологии )
Абсол. кол во НГ % п.Е
100
РОН

39.

Факультет ветеринарной
медицины
1.6.3. Определения ЕАС - РОН (Нестерова И.В., Колесникова Н.В.,
Чудилова Г.А. 1991г.)
В лунку круглодонного планшета вносят 50 мкл клеточной взвеси,
полученной выше описанным способом (1.4.; 1.4.1.), и добавляют 50 мкл
1 % ЕАС - комплекса (способ приготовления описан в пункте 1.5.1-1.5.4).
Инкубируют в термостате 10 минут при 37°С, затем центрифугируют 5
минут при 1500 об/мин. В каждую лунку добавляют по 50 мкл
1 %
глутарового альдегида и оставляют при комнатной температуре на 5-7
минут. Надосадочную жидкость удаляют путем интенсивного
встряхивания с планшета. К осадку добавляют 100 мкл ЗФР. Осадок
осторожно ресуспендируют, и на предметном стекле готовят препараткаплю. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют в
метаноле 10 минут, и окрашивают в течение 5 минут по Романовскому Гимзе в разведении 1:5.

40.

Факультет ветеринарной
медицины
Учет результатов: при увеличении (7×90) ЕАС - РОН подсчитывают в обычном световом микроскопе, на 100-200
нейтрофилов присоединивших 3 и более эритроцита быка
нагруженных антигеном и комплементом. Исходя из общего числа
лейкоцитов;
из морфологии, и % ЕАС - РОН нейтрофилов
определяют абсолютное число ЕАС - РОН.
Абсол. Кол во НГ
Абсол. кол во
Абсол. кол во ЕАС РОН
лейкоцитов % НГ
100
Абс. кол во НГ
из
(в
морфологии )
морфологии % ЕАС РОН
100

41.

Факультет ветеринарной
медицины
1.7.Постановка нагрузочных тестов in vitro
Постановка нагрузочных тестов in vitro целесообразна в тех случаях,
когда проводится лечение соответствующих патологий. Положительные
или отрицательные нагрузочные тесты указывают на эффективность
проводимого лечения и его в прогнозе.
1.7.1 Постановка нагрузочных тестов с тимогеном, аргэхином,
содэхином (Нестерова И.В.. Колесникова HLB., Чудилова Г.А. 1991г.,
Гугушвили Н.Н.2000г.)
Для нагрузочного теста используют следующие концентрации
препаратов: Тимоген - 1,5 • 10-4 мл, Содэхин - 1,2 • 10-3 мл и Аргэхин -1,2
• 10-3 мл для взрослых коров (массой 450-550 кг) и телят (массой 80-116;
303-370 кг). Концетрации препаратов рассчитывались по аналогии
расчета на килограмм массы взрослого животного, и предлагаемых
терапевтических доз для телят.
В пробирку помещают 2 мл цельной крови, куда добавляют 2 мл
препаратов (тимогена,
аргэхина,
содэхина)
рассчитанных в
соответствующих концентрациях. Инкубацию проводят в течение 30
минут в термостате при 37°С, после инкубации из цельной крови
выделяют лейкоциты путем лизиса гемолитической жидкостью
описанным в пункте (1.4.; 1.4.1.). Подсчитывают количество лейкоцитов
в сеточной камере Горяева, доводят ЗФР до рабочей концентрации 2- 4

42.

Факультет ветеринарной
медицины
1.8. Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК)
Метод основан на изменении величины светового рассеивания раствора
полиэтиленгликоля вследствие осаждения ЦИК из сыворотки крови.
Циркулирующие иммунные комплексы возникают в ходе иммунного ответа.
Высокий уровень ЦИК является неблагоприятным признаком, и часто
сопровождает системные заболевания, такие как красная волчанка,
склеродермия и т.д.
1.8.1. Определение количества ЦИК в сыворотке крови (Digeon, 1977 г.)
Кровь берут из вены без добавления антикоагулянта, и инкубируют в течение
2-х часов для осаждения грубодисперсных белков, не имеющих отношения к
ЦИК.
Приготовление боратного буфера: для этого берут 55 мл 1,24 % раствора
борной кислоты добавляют 45 мл 1 % раствора буры. В смесь, добавляют 200
мл дистиллированной воды, доводя рН до 9,18. Готовят 3,75 % раствор
полиэтиленгликоля (ПЭГ 6000) на боратном буфере.

43.

Факультет ветеринарной
медицины
Постановка реакции
В 0,3 мл сыворотки крови добавляют 0,6 мл 0,1 М боратного буфера. Берут
2 пробирки контрольную и опытную. В контрольную пробирку вносят 0,22
мл приготовленной заранее смеси и 2 мл боратного буфера (рН 9,18). В
опытную пробирку вносят 0,22 мл смеси и 2 мл 3,75 % ПЭГ. Обе пробирки
инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Затем определяют
плотность в опыте и контроле на ФЭК (длина волны 450 нм). Количество
ЦИК определяют в условных единицах по формуле:
ЦИК = (E1-Eo) × 1000,
где: E1 - экстинция опытной пробы
Е0- экстинция контрольной пробы.

44.

Факультет ветеринарной
медицины
1.9. Определение содержания иммуноглобулинов (Ig A, Ig M, Ig G) в
сыворотке
крови (Манчини и соавт., 1965г., в модификации Nazayanan Sh,1982 г.)
По концентрации иммуноглобулинов основных (A, M, G) адекватно
оценивается гуморальное звено иммунитета. Принцип метода основан на
иммунологическом феномене преципитации. Антигены (в данном случае
иммуноглобулины исследуемой сыворотки) дифференцируют в геле, образуя
прочные оседлые, локализованные в ячейках геля иммунные комплексы с
антителами (моноспецифической сывороткой против иммуноглобулинов),
содержащиеся в геле. Исследуемая сыворотка, внесенная в лунки,
диффундирует радиально с образованием колец преципитации. По диаметру
кольца преципитации, в сравнении с контролем, определяют концентрацию
антигена.

45.

Факультет ветеринарной
медицины
Приготовление реактивов
Веронал-мединаловый буфер (рН = 8,6) имеет следующий состав: 4,38 г
мединала и 0,69 г веронала растворенного в 1 литре дистиллированной
воды на водяной бане.
Для приготовления агарозы берут 1,5 % агар. К 1,5 г агара добавляют
100 мл веронал-мединалового буфера, закрывают колбу пробкой и варят
на водяной бане 1,5 часа. Приготовленный агар хранят в холодильнике.

46.

Факультет ветеринарной
медицины
Постановка реакции
Перед работой 1,5 % раствор агара подогревают на водяной бане до 50-60 °С.
Затем вскрывают ампулы с антисыворотками A, M, G крупного рогатого скота и
в каждую приливают по 1 мл дистиллированной воды. Ампулы встряхивают до
полного растворения содержимого. В пробирки вносят по 10 мл предварительно
подогретого агара с антисыворотками A, M, G. Агар осторожно приливают, по
стенкам пробирок. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и выливают в
чашки Петри на ровную поверхность для получения равномерного слоя и
оставляют при комнатной температуре до остывания. Затем чашки Петри с
агаром ставят на 20 минут в холодильник. На миллиметровую бумагу
устанавливают чашку Петри с агаром, содержащим анти- IgA-сыворотку, и
пробойником делают в агаре лунки
d =2 мм на расстоянии 15 мм друг от друга. Начало отсчета на чашке Петри
отмечают карандашом. Аналогично пробивают лунки в агаре, содержащим
анти-IgM- и aнти-IgG-сыворотки. Перед заполнением лунок исследуемыми
сыворотками, чашки Петри ставят на черную бумагу и вносят по 20 мкл
исследуемой сыворотки и стандартную сыворотку - известной концентрации
разведенную физиологическим раствором 1:1. Чашки Петри помещают во
влажный эксикатор, который ставят на холод (4°С) для IgA - и -IgG тестирования - на 24 часа, а для IgM - оценки - на 48 часов. По истечении

47.

Факультет ветеринарной
медицины
Уровень иммуноглобулинов определяют по формуле:
Расчет концентрации искомой сыворотки:
а) определение коэффициента наклона (КН) стандартной сыворотки (1:1)
КН
d 2 стандарт. сыворотки
концентр.
стандарт.
сыворотки
где d -квадрат кольца преципитации
б) концентрация исследуемой сыворотки (С)
d 2 исследуемой сыворотки
С = ———————————————— = мг /
мл
КН

48.

Факультет ветеринарной
медицины
1.10. Реакция бактериального фагоцитоза нейтрофилов с определением степени
завершенности (Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. 1989 г.)
Оценка основной функции нейтрофилов - фагоцитарной с определением степени
завершенности фагоцитарного акта (килинг, переваривания) позволяет судить о
состоятельности неспецифического звена иммунной системы, и, в частности,
системы НГ при бактериальной инфекции и других агентов воздействия. Принцип
основан на количественном определении поглощенных и переваренных
нейтрофилами микроорганизмов при совместной инкубации исследуемой крови с
микробной тест культурой Staphylococcus aureus (штамма 209).
Уничтожение живых объектов, или завершенный фагоцитоз, следует рассматривать
как итоговый феномен, в котором сфокусированы многие звенья эффекторного
потенциала клетки - рецепция, поглощение, активация метаболизма, секреторная
дегрануляция, образование пищеварительных вакуолей - фагосом. После образования
фагосомы, захваченный микроорганизм подвергается действию целого ряда
бактерицидных механизмов. Уничтожение чужеродных клеток проходят по двум
механизмам - кислородзависимым и кислороднезависимым.

49.

Факультет ветеринарной
медицины
Кислородзависимые механизмы
Происходит резкая активация гексозомонофосфатного шунта,
генерирующего НАДФ-Н, который используется для восстановления
молекулярного кислорода, связанного с уникальным мембранным
цитохромом b-245, что вызывает бурное потребление кислорода. В
результате образуются надпероксидный анион, пероксид водорода,
сиглентный кислород и гидроксильные радикалы, - которые служат
мощными бактерицидными агентами. Сочетание пероксида,
миелопероксидазы и ионов галогенов создает мощную систему
галогенирования, способную вызвать гибель, как бактерий, так и
вирусов.

50.

Факультет ветеринарной
медицины
Кислороднезависимые механизмы
При реализации этого процесса происходят дисмутации надпероксидазы,
потребляются ионы водорода и слегка повышается рН, а это создаст оптимальные
условия для функционирования семейства катионных белков, которые еще не
полностью охарактеризованы. Эти белки разрушают бактериальную мембрану как
за счет протеиназного эффекта (нейтральная протеиназа, катепсин G), так и за
счет непосредственного присоединения к поверхности микроорганизма. Низкие
значения рН, лизоцим и лактоферрин представляет собой кислороднезависимые
бактерицидные и бактериостатические факторы, которые могут действовать в
анаэробных условиях. Убитые микроорганизмы расщепляются гидролитическими
ферментами и продукты дегенерации высвобождаются из клетки.

51.

Факультет ветеринарной
медицины
Получение проб крови, молока, молозива и маточной слизи или лохий
проводят по описанной выше методике.
Для определения степени завершенности фагоцитоза берут каплю венозной
крови на середину хорошо обезжиренного стекла, добавляют 10 мкл
гепарина, затем 10 мкл
мясопептонного бульона и 10 мкл микробной взвеси лабораторного штамма
№ 209 на физиологическом растворе в концетрации 1 ×106. Покачиванием
предметного стекла хорошо перемешивают ее содержимое и затем
инкубируют в течение 120 минут во влажной камере в термостате при
температуре 37 °С. После инкубации излишек крови осторожно удаляется
при наклоне предметного стекла под углом 45°, и на предметном стекле
остается микролейкоконцентрат, ограниченный хорошо видимыми
контурами капли. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют в течение
5минут в метаноле. Зафиксированные мазки окрашивают по Романовскому в
течение 5-10 минут. Промывают дистиллированной водой, высушивают на
воздухе, затем микроскопируют под иммерсией при увеличении 10×90.

52.

Факультет ветеринарной
медицины
Оценка поглотительной способности и переваривающей функции фагоцитов
Для оценки поглотительной функции фагоцитов: в мазке подсчитывается 100
нейтрофилов, в каждом из них определяется: - есть или нет внутриклеточно
расположенные бактерии; - количество убитых и разрушенных бактерий; - количество
живых бактерий.
Определяются следующие показатели:
«Активный» нейтрофил — нейтрофил, поглотивший микроб(ы). Процент фагоцитоза
(% ФА) —процент «активных» нейтрофилов из общего числа посчитанных
нейтрофилов.
Фагоцитарное число (ФЧ)—среднее число фагоцитированных микробов, деленное на 1
активный нейтрофил (ФА) Оценка поглотительной способности и переваривающей
функции фагоцитов

53.

Факультет ветеринарной
медицины
Для оценки поглотительной функции фагоцитов: в мазке подсчитывается 100
нейтрофилов, в каждом из них определяется: - есть или нет внутриклеточно
расположенные бактерии; - количество убитых и разрушенных бактерий; количество живых бактерий.
Определяются следующие показатели:
«Активный» нейтрофил — нейтрофил, поглотивший микроб(ы). Процент
фагоцитоза (% ФА) —процент «активных» нейтрофилов из общего числа
посчитанных нейтрофилов.
Фагоцитарное число (ФЧ)—среднее число фагоцитированных микробов,
деленное на 1 активный нейтрофил (ФА)
М
ФЧ
ФА
,
где М– число фагоцитированных микробов

54.

Факультет ветеринарной
медицины
Фагоцитарный интегральный индекс (ФИИ)
М
ФИИ
Ф
,
где Ф - 100 посчитанных нейтрофилов.
Завершенность фагоцитарного акта оценивают по показателям:
Процент переваривания (%П) - отношение числа убитых бактерий (Муб) к общем
фагоцитированных бактерий (м)
%П
М уб 100
м
Индекс переваривания (ИП)- среднее число убитых микробов на 1 подсчитанный
нейтрофил (ф), т.е. на 100 клеток
ИП
М уб 100
ф

55.

Факультет ветеринарной
медицины
Интегральный показатель переваривающей активности (ИППА) позволяет оценить фагоцитарную активность нейтрофилов в абсолютных
значениях
% нейтрафилов % фагоцитоза % переваривания
ИППА
100 10

56.

Факультет ветеринарной
медицины
1.11. Определение лизоцимной активности в сыворотке крови
(Стогник В.И., Голик В.П., 1989 г.)
Лизоцим является одним из показателей естественной резистентности и
отвечает за бактерицидность крови, слюны и других биологических
жидкостей.
В основу данного метода положена способность лизоцима быстро
лизировать эталонную культуру Mycroccocus lisodeiticus.
1.11.1. Методика определения лизоцимной активности
В химическую пробирку вносят 4,9 мл 0,5 % раствора хлорида натрия и 0,1
мл сыворотки крови, добавляя в нее 1 млрд. суспензии Mycroccocus
lisodeiticus. Измеряют оптическую плотность приготовленной суспензии на
спектрофотометре (СФ - 46) с длиной волны λ = 540 нм (зеленый
светофильтр). Затем пробирки помещают в термостат, при температуре 37°С
на три часа для инкубации. После инкубации вновь измеряют оптическую
плотность.
Оценка результатов лизоцимной активности (ЛА) проводится с помощью

57.

Факультет ветеринарной
медицины
Расчет лизоцимной активности производят по формуле:
( Д1 К Д 0 )
ЛА
Д1 К
где ЛА - лизоцимная активность сыворотки крови в (%)
До и Д1 - оптическая плотность содержимого испытуемых проб
соответственно до и после инкубации;
К - константа, равная 1,0 - для крупного рогатого скота.

58.

Факультет ветеринарной
медицины
1.12. Определение бактерицидной активности в сыворотке крови БАСК
(О.В Смирнов., Т.А Кузьмина. 1989 г.)
Метод основан на свойствах сыворотки крови, оказывать бактерицидное
и бактериологическое действие на микроорганизмы (тест - E.coli).
Используемый фотонефелометрический метод основан на учете
изменения оптической плотности питательной среды при добавлении в
нее сыворотки.
Наибольшее распространение в практике получил упрощенный
фотонефелометрический метод определения БАСК по О.В. Смирнову и
Т.А. Кузьминой.

59.

Факультет ветеринарной
медицины
1.12.1. Метод определения бактерицидной активности в сыворотке крови
На физиологическом растворе готовят смесь из суточной культуры Е. Coli,
определяют ее оптическую плотность на спектрофотометре λ = 460 мкм.
В пробирки вносят стерильно по 4,5 мл мясопептонного бульона. В обычную
пробирку добавляют 1 мл исследуемой сыворотки, а в контрольную 1 мл
физиологического раствора. Для получения очищенной сыворотки от
форменных элементов и пластин, проводят осаждение примесей
центрифугированием. Затем во все пробирки вносят (с помощью
микропипетки или шприца) по одной капле 24 - часовой культуры Е. Coli.
Содержимое пробирок перемешивают и измеряют оптическую плотность на
спектрофотометре СФ - 46. Смесь, оставшуюся в пробирках, инкубируют в
термостате три часа при температуре 37°С, после чего вновь измеряют
оптическую плотность содержимого пробирок.

60.

Факультет ветеринарной
медицины
Бактерицидную активность сыворотки крови вычисляют по следующей
формуле:
БАСК (%) 100
Д 0 через 3 часа Д 0 перед инкубаций
100
Д к через 3 часа Д к перед инкубацией
где БАСК- бактерицидная активность в (%)
До- оптическая плотность опытной пробирки; Дк - оптическая
плотность контрольной пробирки.

61.

Факультет ветеринарной
медицины
ОПРЕДЕЛЕНИЕ Т-, В-, NK-ЛИМФОЦИТОВ В МАЗКАХ КРОВИ ЖИВОТНЫХ
(по Пирсу,1962 г., в модификации Гугушвили Н. Н., 2000 г.)
Данная методика является экспресс методом для определения. неспецифической эстеразы в
клетках крови: Т-, NK - лимфоцитов Эстеразы входят в подгруппу (3.1). Механизм их действия на
бактерии заключается в их переваривании благодаря способности гидролизовать белковые субстраты.
Эстераза, или эластаза разрушает пептидогликаны бактериальной стенки. Одновременно в одном
препарате можно определить В - клетки по окраске ядер. Применение методики основано на
взаимодействии неспецифической эстеразы с α- нафтилацетатом. Эстераза способствует
гидролизу α- нафтилацетата с образованием α - нафтола и уксусной кислоты (первичная реакция),
которая создает слабокислую среду. Для поддержания рН в пределах 8,0 - 8,2 в систему вводят
буферную смесь, предложенную нами, состоящую из КН2РО4 и Na2HРО4, что оказывало влияние на
активность фермента эстеразы. Затем а- нафтол взаимодействует с красителем - нейтральным
прочным синим В с образованием комплексного соединения азокрасителя (вторичная реакция).
Образовавшийся комплекс (азокраситель) окрашивает эстеразу содержащуюся внутри Т-, и NКлимфоцитов.
Кровь для исследования берут у сельскохозяйственных животных из яремной вены, из которой
готовят мазок. Для этого каплю, крови наносят на край сухого обезжиренного стекла, которое
удерживают между большим и средним пальцами левой руки. Впереди капли под углом 45° подводят
шлифованный край покровного стекла так, чтобы образовавшийся угол между стеклами был
равномерно заполнен кровью. Движением правой руки от себя каплю распределяют тонким слоем по
поверхности предметного стекла без просветов в виде равномерной полоски, не выходящей за ее
края. Мазки сушат на воздухе и фиксируют в парах 40% раствора формалина в течение 5 минут.

62.

Факультет ветеринарной
медицины
Приготовление буферных растворов
В состав буферной смеси входят: раствор А и Б в соотношении 1:20.
Приготовление раствора А. Для приготовления раствора А берут 0,34 г КН2РО4 (однозамещенного
фосфорнокислого калия) и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, затем в мерной
колбе объемом 25 мл доводят до метки.
Приготовление раствора Б. Берут 8,9 г Na2HPO4, (двузамещенного
фосфорнокислого натрия) и растворяют в небольшом количестве дистиллированной
воды и в мерной колбе объемом 500 мл доводят до метки. Для лучшей диффузии
растворы А и Б оставляют на сутки в темном месте. Затем смешивают 25 мл раствора А
и 475 мл раствора Б, оставляют на сутки и змеряют рН буферного раствора. При этом
необходимо получить рН от 8,0 до 8,2.
Приготовление инкубационной смеси
Правильное приготовление инкубационной смеси имеет немаловажное значение
для дальнейшей окраски мазков. Готовят раствор 1 и 2.
Приготовление раствора 1
2,5 мг - нафтилацетата растворяют в 0,125 мл ацетона разбавленного таким же
количеством дистиллированной воды, добавляя небольшими порциями. После
растворения к нему постепенно добавляют 6,25 мл дистиллированной воды.
Приготовление раствора 2
6,25 мг нейтрального прочного синего В растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды,
смешивая их постепенно. Для поддержания рН добавляют 0,125 мл буферного раствора с рН = 8,0-8,2.
Полученные растворы 1 и 2 смешивают, фильтруют в темной комнате через стеклянный фильтр.

63.

Факультет ветеринарной
медицины
Инкубация мазков
Инкубацию мазков проводят в темной комнате в течение 2-х часов. На
фиксированные формалином мазки наносят равномерным слоем инкубационную
смесь. Периодически добавляют инкубационную смесь, так как происходит
испарение жидкости, которая включает в себя легко улетучивающиеся вещества
(ацетон, нафтилацетат). После инкубации мазки промывают дистиллированной
водой и высушивают на воздухе.
Для дифференцировки лимфоцитов от других клеток крови в дальнейшем
окрашивают ядра клеток (0,5–1 минуту) 0,25 % водным раствором Азуром-II,
или 0,5% нейтральным красным, приготовленным на физиологическом растворе.
Затем краску сливают, промывают дистиллированной водой, мазки высушивают
на воздухе в темной комнате.
Микроскопия мазков
Микроскопию проводят при увеличении (90×15) с использованием
иммерсионной системы. При этом Т- лимфоциты содержат одну или несколько
гранул темного цвета расположенных по периферии клетки, ядра хорошо
выражены; в NK- клетках ядра хорошо выражены, а цитоплазма окрашена
диффузно в серый цвет. В- лимфоциты имеют хорошо выраженные ядра, со
слабо окрашенной цитоплазмой, клетки гранул не содержат.

64.

Факультет ветеринарной
медицины
Реакция бактериального фагоцитоза нейтрофилов с определением степени
завершенности
(НЕСТЕРОВА
И.В.,
КОЛЕСНИКОВА
Н.В.,
ЧУДИЛОВА Г.А. 1989 Г.)
Оценка основной функции нейтрофилов – фагоцитарной с определением степени
завершенности фагоцитарного акта (килинг, переваривания) позволяет судить о
состоятельности неспецифического звена иммунной системы, и, в частности, системы НГ при
бактериальной инфекции и других агентов воздействия. Принцип основан на количественном
определении поглощенных и переваренных нейтрофилами микроорганизмов при совместной
инкубации исследуемой крови с микробной тест культурой Staphylococcus aureus (штамма
209).
Уничтожение живых объектов, или завершенный фагоцитоз, следует рассматривать как
итоговый феномен, в котором сфокусированы многие звенья эффекторного потенциала клетки
- рецепция, поглощение, активация метаболизма, секреторная дегрануляция, образование
пищеварительных вакуолей - фагосом. После образования фагосомы, захваченный
микроорганизм подвергается действию целого ряда бактерицидных механизмов. Уничтожение
чужеродных клеток проходят по двум механизмам - кислородзависимым и кислород
независимым.

65.

Факультет ветеринарной
медицины
Кислородзависимые
механизмы.
Происходит
резкая
активация
гексозомонофосфатного шунта, генерирующего НАДФ-Н, который используется для
восстановления молекулярного кислорода, связанного с уникальным мембранным
цитохромом b-245, что вызывает бурное потребление кислорода. В результате
образуются надпероксидный анион, пероксид водорода, сиглентный кислород и
гидроксильные радикалы, которые служат мощными бактерицидными агентами.
Сочетание пероксида, миелопероксидазы и ионов галогенов создает мощную
систему галогенирования, способную вызвать гибель как бактерий, так и вирусов.
Кислороднезависимые механизмы. При реализации этого процесса
происходят дисмутации надпероксидазы, потребляются ионы водорода и слегка
повышается рН, а это создаст оптимальные условия для функционирования
семейства катионных белков, которые еще не полностью охарактеризованы. Эти
белки разрушают бактериальную мембрану как за счет протеиназного эффекта
(нейтральная протеиназа, катепсин G), так и за счет непосредственного
присоединения к поверхности микроорганизма. Низкие значения рН, лизоцим и
лактоферрин представляет собой кислороднезависимые бактерицидные и
бактериостатические факторы, которые могут действовать в анаэробных условиях.
Убитые микроорганизмы расщепляются гидролитическими ферментами и продукты
дегенерации высвобождаются из клетки.

66.

Факультет ветеринарной
медицины
Получение проб крови, молока, молозива и маточной слизи или лохий
проводят по описанной выше методике.
Для определения степени завершенности фагоцитоза берут каплю
венозной крови на середину хорошо обезжиренного стекла, добавляют 10
мкл гепарина, затем 10 мкл мясопептонного бульона и 10 мкл микробной
взвеси лабораторного штамма № 209 на физиологическом растворе в
концетрации 1×106. Покачиванием предметного стекла хорошо
перемешивают ее содержимое и затем инкубируют в течение 120 минут во
влажной камере в термостате при температуре 37°С. После инкубации
излишек крови осторожно удаляется при наклоне предметного стекла под
углом 45°, и на предметном стекле остается микролейкоконцентрат,
ограниченный хорошо видимыми контурами капли. Мазки высушивают на
воздухе и фиксируют в течение 5минут в метаноле. Зафиксированные мазки
окрашивают по Романовскому в течение 5–10 минут. Промывают
дистиллированной водой, высушивают на воздухе, затем микроскопируют
под иммерсией при увеличении 10×90.

67.

Факультет ветеринарной
медицины
Оценка поглотительной способности и переваривающей функции фагоцитов
Для оценки поглотительной функции фагоцитов: в мазке подсчитывается 100
нейтрофилов, в каждом из них определяется: есть или нет внутриклеточно
расположенные бактерии; – количество убитых и разрушенных бактерий; - количество
живых бактерий.
Определяются следующие показатели:
«Активный» нейтрофил – нейтрофил, поглотивший микроб (ы). Процент фагоцитоза
(% ФА) – процент «активных» нейтрофилов из общего числа посчитанных
нейтрофилов.
Фагоцитарное число (ФЧ)—среднее число фагоцитированных микробов, деленное на
1активный нейтрофил (ФА)
М
ФЧ
ФА
где М – число фагоцитированных микробов

68.

Факультет ветеринарной
медицины
Фагоцитарный интегральный индекс (ФИИ)
М
ФИИ
Ф
где Ф - 100 посчитанных нейтрофилов.
Завершенность фагоцитарного акта оценивают по показателям:
Процент переваривания (% П) - отношение числа убитых бактерий
(Муб) к общему числу фагоцитированных бактерий (м)
%П
М уб 100
м

69.

Факультет ветеринарной
медицины
Индекс переваривания (ИП) – среднее число убитых микробов на 1
подсчитанный нейтрофил (ф), т.е. на 100 клеток
ИП
М уб 100
ф
Интегральный показатель переваривающей активности (ИППА) –позволяет оценить фагоцитарную активность нейтрофилов в абсо абсолютных
значениях:
% нейтрафилов % фагоцитоза % переваривания
ИППА
100 10

70.

Факультет ветеринарной
медицины
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ
(по Sato, 1928г., в модификации Гугушвили Н.Н., 2000г.)
Активность миелопероксидазы присуща молодым клеткам. Обычно активность
фермента высокая в клетках крови у клинически здоровых животных, а у
больных снижена. Так, ее снижение в нейтрофилах обнаружено при
инфекционных лейкоцитозах и некоторых метастазирующих опухолях.
Определение миелопероксидазы (пероксидазы) – является одним из звеньев
выявления микробицидных свойств системы крови. Простетическая в
пероксидазе группа представлена гемом. Пероксидаза донор: Н2О2 –
оксидоредуктаза, (код фермента (КФ) – 1.11.1.7) относятся к оксидоредуктазам
(1). Фермент катализирует окисление различных веществ с помощью перекиси
водорода: Донор + Н2О2 = Окислительный донор + 2Н2О.
Данный метод является быстрым и точным. Фермент пероксидаза поступает из
тканей (жировых) в форменные элементы крови и локализуется в их цитоплазме
в виде гранул (лизосом).

71.

Факультет ветеринарной
медицины
Для обнаружения миелопероксидазы применяют метод бензидиновой
реакции, основанный на окислении бензидина пероксид-пероксидазной
системой
до
нестабильного
бензидинового
синего,
который
самопроизвольно превращается в стабильный бензидиновый коричневый.
Пероксидаза относится к железопорфириновым соединениям, поэтому
добавление в инкубационную смесь медного купороса (CuSO4·5H2O)
приводит к замещению свободных ионов железа в геме (ионы железа
вытесняют медь из их соединений), и ионы меди проникают внутрь
цитоплазмы нейтрофилов, образуя комплекс с бензидином (гранулы).
Последние становятся стойко окрашенными в сине-коричневый цвет, по
которому можно определить активность миелопероксидазы в нейтрофилах.
Для активации миелопероксидазы в инкубационную систему вводят
буферную смесь с pH =7,2–7,5, состоящую из трис (гидроксиметил)
аминометан -C4H11NO3 (с относительной молекулярной массой М 121,14) и
0,1 М HCl.

72.

Факультет ветеринарной
медицины
Фиксация мазков
На приготовленные высушенные мазки крови наливают 96 об.%о этиловый
спирт и фиксируют в течение 3–4 минут в парах 40% формалина. Для этого на
дно эксикатора наливают около 150 мл формалина, оставляют под закрытой
крышкой на 30 минут для возгонки паров формалина.
Приготовление буферных растворов
В состав буферной смеси входят: 0,1 М раствор триса C4H11NO3 (молекулярной
массой 121,14), 0,1 М НСl (молекулярной массой 36,465). К 50 мл 0,1 М
раствора триса добавляют 44,7 мл 0,1 М раствора НСl и доводят
дистиллированной водой до 100 мл. Раствором 0,1 М НСl доводят рН смеси до
7,2 –7,5.
Приготовление инкубационной смеси
В инкубационную смесь входят растворы 1 и 2.
Приготовление раствора 1
1 г медного купороса растворяют в небольшом количестве воды и доливают до
100 мл буферной смесью (рН = 7,5).
Приготовление раствора 2
10 мг основного бензидина растворяют в 1,5 мл 96 об % этиловом спирте,
добавляют 10 мл дистиллированной воды небольшими порциями. Затем в
раствор вносят 14 мл буферной смеси, и 2-3 капли 1 % раствора перекиси
водорода. Полученный раствор фильтруют через стеклянный фильтр.

73.

Факультет ветеринарной
медицины
Инкубация мазков
После фиксации мазки хорошо промывают в дистиллированной воде и сушат на
воздухе. Инкубацию проводят в темной комнате в течение 3-х минут. На
фиксированные формалином мазки равномерным слоем наносится инкубационная
смесь – сначала раствор 1 на одну минуту, а после промывки дистиллированной
водой, наносят раствор 2 – на две минуты. Затем мазки промывают в
дистиллированной воде и высушивают на воздухе.
В дальнейшем для дифференцировки нейтрофильных гранулоцитов от других
клеток крови их ядра докрашивают (0,5–1 минуту) 0,5% раствором нейтральным
красным, приготовленным на физиологическом растворе. Затем краску сливают,
промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
Микроскопия мазков
Микроскопию проводят при увеличении (90×15) с использованием иммерсионной
системы. Активность миелопероксидазы определяют по количеству гранул синекоричневого цвета в цитоплазме нейтрофилов, ядра которых докрашены в
красный цвет. Визуально проводят оценку цитохимической реакции по
Kaplow,1955г. (рис.2.).

74.

Факультет ветеринарной
медицины
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В МАЗКАХ
КРОВИ ЖИВОТНЫХ
(по Шубичу М.Г., 1965г., в модификации Гугушвили Н.Н., 2000г.)
Фосфатазы относятся к гидролазам (3), щелочная фосфатаза (3.1.3.1.), которая способна
разрывать связи Р --- О. Щелочная фосфатаза катализирует реакцию гидролиза моноэфира
ортофосфата, расщепляя на спирт и фосфорную кислоту:
Моноэфир ортофосфат + Н2О = Спирт + Н3РО4
Активность щелочной фосфатазы присуща зрелым клеткам. Резкое уменьшение активности
фермента в клетках приводит к снижению иммунитета, который наблюдается при
хроническом миелолейкозе. Понижение естественной резистентности влечет за собой
нарушение гомеостаза организма и приводит к снижению сохранности молодняка,
репродуктивной способности и т. д.
Данный способ определения щелочной фосфатазы является наиболее быстрым и точным, т.к.
фермент поступает из тканей, где они выполняют определённые внутриклеточные функции в
форменные элементы крови, и локализуются в их цитоплазме в виде гранул – лизосом.
В инкубационной смеси щелочная фосфатаза приводит к ферментативному расщеплению α нафтилфосфата до α-нафтола и двузамещенного фосфорнокислого натрия (первичная
реакция). Затем α-нафтол связывается с прочным синим В, образуя азокраситель (вторичная
реакция).

75.

Факультет ветеринарной
медицины
Фиксация мазков
Мазки крови сушат на воздухе и фиксируют в парах 40 % формалина в течение 3–4минут.
Приготовление буферных растворов
В состав буферной смеси входят (раствор – А): 0,025 М тетраборат натрия (Na2B407·10H20 с
относительной молекулярной массой 382), для этого тетраборат натрия 0,953 г растворяют в
дистиллированной воде в мерной колбе объёмом на 100 мл; (раствор – Б) - 0,1 М HCl (с
относительной молекулярной массой 36,465). К 50 мл раствора А - добавляют раствор Б 4,6
- 5 мл. Доводят рН смеси до 9,18– 9,19.
Приготовление инкубационной смеси
Инкубационную смесь готовят в затемненной комнате. Для этого готовят раствор 1 и 2.
Приготовление раствора 1
В состав раствора 1 входят: 2,5 мг α-нафтилфосфат натрия и 2,5 мл боратного буфера.
Растворяют α-нафтилфосфат натрия в небольшом количестве, а затем постепенно
добавляют остальную часть боратного буфера.
Приготовление раствора 2
5 мг нейтрального прочного синего растворяют в 2,5 мл боратного буфера, смешивая их
постепенно (рН = 9,18).
Полученные растворы 1 и 2 смешивают, фильтруют через стеклянный фильтр.

76.

Факультет ветеринарной
медицины
Инкубация мазков
На фиксированные формалином мазки наносят равномерным слоем
инкубационную смесь. Необходимо строго соблюдать температурный режим
(18–200С), т.к. фермент активен при данной температуре. После инкубации
мазки промывают под проточной водой 10 минут, а затем – дистиллированной
водой и высушивают на воздухе. В дальнейшем для дифференцировки
нейтрофильных гранулоцитов от других клеток крови ядра клеток
окрашивают (0,5–1 минуту) 0,5% раствором сафранина или нейтрального
красного приготовленного на физиологическом растворе.
Микроскопия мазков
Микроскопию проводят при увеличении (90×15) с использованием
иммерсионной системы. Активность щелочной фосфатазы определяют по
количеству гранул коричневого цвета в цитоплазме нейтрофилов, ядра
которых докрашены в красный цвет. Визуально проводят оценку
цитохимической реакции по Kaplow, 1955г.

77.

Факультет ветеринарной
медицины
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ В МАЗКАХ КРОВИ И В
БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
(по Шубичу М.Г.., 1980г., в модификации Гугушвили Н.Н., 2000 г.)
Кислая фосфатаза локализуется в НГ, относится к гидролазам - 3 (КФ 3.1.3.2.),
которая способна разрывать связи Р --- О. Кислая фосфатаза катализирует реакцию
гидролиза моноэфира ортофосфата, расщепляя на спирт и фосфорную кислоту:
Моноэфир ортофосфат + Н2О = Спирт + Н3РО4
Кислая фосфатаза присуща молодым клеткам. По повышению или понижению
активности кислой фосфатазы в той или иной степени можно судить о патологическом
процессе в организме животных. Так, снижение активности фермента в лимфоцитах
наблюдается при хроническом лимфолейкозе, а повышение при инфекционном
мононуклеозе.
Данный способ может быть экспресс методом для проведения цитохимического
анализа активности кислой фосфатазы в нейтрофильных гранулоцитах в мазках крови.
Применение методики основано на взаимодействии кислой фосфатазы с αнафтилфосфатом натрия. Фосфатаза катализирует гидролиз α-нафтилфосфата натрия с
образованием α-нафтола и фосфорнокислого двузамещенного натрия (первичная
реакция). Для активации кислой фосфатазы в систему нами предложено ввести
буферную смесь, янтарную кислоту (C4H6O4 с молекулярной массой 118,09), которая
является естественным субстратом клеточных ферментов, участвующих в основном при
внутриклеточном дыхании в синтезе АТР. Затем α-нафтол взаимодействует с красителем
нейтральным прочным синим В с образованием комплексного соединения азокрасителя
(вторичная реакция). Образовавшийся комплекс (азокраситель) окрашивает, кислую
фосфатазу, содержащуюся внутри в виде гранул в цитоплазме нейтрофильных
гранулоцитов.

78.

Факультет ветеринарной
медицины
Фиксация мазков
Мазки готовят сразу после взятия крови и сушат на воздухе, затем фиксируют в
парах 40% формалина в течение 3–4 минут.
Приготовление буферных растворов
В состав буферной смеси входят раствор А и Б : 0,2М раствор янтарной кислоты (с
молекулярной массой 118,09), раствор – А, для этого берут 2,362 г янтарной
кислоты и растворяют в дистиллированной воде в объёме на 100 мл; раствор – Б
0,2 М NaOH (молекулярной массой 36,465). Затем к 25 мл раствора А –(янтарной
кислоты), добавляют 12 мг ЭДТА и 0,2М NaOH 32 мл, доводят рН до 4,9–5,0.
Приготовление инкубационной смеси
Инкубационную смесь готовят в затемненной комнате. Для этого готовят раствор 1
и 2.
Приготовление раствора 1
2,0 мг α-нафтилфосфата натрия растворяют в 1,3 мл дистиллированной воды и в
0,6612 мл буферной смеси, добавляя небольшими порциями, перемешивая.
Приготовление раствора 2
5 мг нейтрального прочного синего В растворяют в 2,5 мл буферной смеси,
смешивая их постепенно (рН = 5,0).
Полученные растворы 1 и 2 смешивают, фильтруют в темной комнате через
стеклянный фильтр.

79.

Факультет ветеринарной
медицины
Инкубация мазков
На фиксированные формалином мазки наносится равномерным слоем
инкубационная смесь. Периодически необходимо добавлять смесь, так как
происходит испарение жидкости, которая включает в себя легко улетучивающееся
вещество (α- нафтол) и при температуре 37–38оС в течение 2-х часов. После
инкубации мазки промывают под проточной водой, затем дистиллированной водой
и высушивают на воздухе в темной комнате.
Для дифференцировки НГ от других клеток крови в дальнейшем окрашивают ядра
клеток (0,5–1 минуту) 0,5% водным раствором метиленовой сини. После окраски
мазки промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в темной
комнате.
Микроскопия мазков
Микроскопию проводят при увеличении (90×15) с использованием иммерсионной
системы. Активность кислой фосфатазы определяют по количеству гранул краснокоричневого цвета в цитоплазме нейтрофилов, ядра которых докрашены в голубой
цвет. Визуально проводят оценку цитохимической реакции по Kaplow, 1955г.
(рис.2).

80.

Факультет ветеринарной
медицины
ЛИЗОСОМАЛЬНО-КАТИОННЫЙ ТЕСТ ПО
В. М. Пигаревскому (1979г.)
Принцип метода основан на цитохимическом выявлении лизосомально- катионных
белков, которые, связываясь с красителем прочным зелёным при рН 8,0–8,2,
окрашивают лизосомы нейтрофилов в зелёный цвет. Под микроскопом окрашенные
лизосомы выглядят как бирюзовые гранулы. Катионные белки (КБ) обладают
протеолитическими и биоцидными свойствами. Уровень их содержания оценивается
по количеству гранул, и по интенсивности их окраски можно судить о состоянии
кислороднезависимой биоцидной системы нейтрофила. КБ относят к неферментным
системам, играют важную роль в реализации фагоцитарной функции клеток, не
вызывают привыкание к себе микроорганизмов, увеличивают проницаемость
клеточных мембран и сосудистой стенки. Вызывает дегрануляцию тучных клеток,
тем самым повышает содержание гистамина. КБ проявляет активность против
грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибков и вирусов. В основе
антибактериального действия лежит их электростатистическое взаимодействие с
анионными компонентами бактериальной стенки. КБ амфотерные электролиты,
состоящие из полипептидных цепей с разнородными концевыми группами NH2+ и
СООН-. Заряд белка может меняться от значения рН. Бактериальное действие
снижается параллельно снижению величины рН. Катионные белки вместе с
перекисью и галоидами образуют мощную бактерицидную систему нейтрофила.

81.

Факультет ветеринарной
медицины
Приготовление буферного раствора и инкубационной смеси
В состав буферной смеси входят: 0,1М раствор триса, раствор – А, для этого
берут 2,423 г триса (молекулярной массой 121,14) и растворяют в
дистиллированной воде в объёме на 100 мл; затем готовят раствор – Б ,
состоящий из 0,1 М HCl (молекулярной массой 36,465). К 50 мл раствора А
добавляют раствор Б - 22-26 мл доводят до 100 мл дистиллированной водой.
рН раствора 8,1-8,2.
Приготовление забуференного спиртового раствора прочного зеленого В
К 50 мл раствора А –(триса) добавляют 105 мл метанола и раствор Б 0,1М
HCl – 45мл, которым доводят рН до 8,1- 8,2. Затем 100 мг прочного зеленого
В растворяют в 100 мл метанолового буфера.
Фиксация и инкубация мазков
Фиксация и инкубация мазков проводится одновременно забуференным
спиртовым раствором прочного зеленого В в течение 15 минут. После
инкубации мазки промывают под проточной водой, затем дистиллированной
водой и высушивают на воздухе в темной комнате. Затем докрашивают ядра
клеток (2–3 минуты) 0,25%-ным раствором азура- II. Краску сливают,
промывают дистиллированной водой и сушат мазки на воздухе в темном
месте.

82.

Факультет ветеринарной
медицины
Микроскопия мазков
Микроскопию проводят при увеличении (90×15) с использованием
иммерсионной системы. Лизосомально-катионные белки окрашены в
бирюзовый, а ядра клеток - в сиреневый цвет. Визуально проводят оценку
цитохимической реакции по Kaplow ,1955г.

83.

Факультет ветеринарной
медицины
СПОНТАННЫЙ И СТИМУЛИРОВАННЫЙ NBT-ТЕСТ
(Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., 1980г.)
Принцип метода основан на цитохимическом выявлении темно-синих гранул, которые
образуются в цитоплазме нейтрофила в результате восстановления растворимого нитросинего
тетразолия до нерастворимого бисформазана. Нитросиний теразолиевый тест (NBT-тест) проводят
в двух вариантах: спонтанном (базальном) и стимулированном. Результаты спонтанного теста
указывают на степень активации кислородзависимых механизмов фагоцитоза у животных под
влиянием внутренних причин, например, инфекции. Результаты стимулированного теста дают
представление о способности нейтрофилов к активации in vitro под воздействием стимуляторов
(бактерий – Staphylococcus aureus, лабораторный штамм 209 в разведении 1 млрд. микробных тел в
1мл физиологического раствора). NBT-тест имеет преимущество перед другими цитохимическими
реакциями: во-первых, он выявляет компоненты, которые возникают только при стимуляции,
поэтому дифференцирует спонтанные и стимулированные клетки; во- вторых отражает степень
завершенности фагоцитоза. Данный тест является индикатором нормы и патологии гомеостаза.
NBT-тест отражает степень активации кислородзависимого метаболизма, прежде всего
функцию ГМФШ (гексозомонофосфатный шунт) и связанных с ним свободных радикалов.
Никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФН) – оксидазный комплекс локализуется в плазматической
мембране и при фагоцитозе вместе с ней инвагинируется во внутрь клетки. Поэтому активация,
связанная с поглощением сопровождается внутрифагосомальным восстановлением NBT.

84.

Факультет ветеринарной
медицины
Кровь берут из вены и стабилизируют 2,7%-ным раствором ЭДТА в соотношении
10:1(10 частей крови и 1 часть ЭДТА). Затем хорошо перемешивают и наносят
каплю крови на середину двух хорошо обезжиренных предметных стекол. В эту же
каплю крови добавляют 10 мкл гепарина в разведении 2 единицы гепарина, в NBTстимулированный тест добавляют 10 мкл бактериальной взвеси St.aureus в
концентрации 1·106 мкл/мл с эталонной взвеси микроба 6 единиц и 10 мкл 0,1 %ного раствора нитросинего тетразолия (водного), а в NBT-спонтанный – 10 мкл
физиологического раствора (рН = 7,0) и 10 мкл 0,1%-ного раствора нитросинего
тетразолия (водного). Перемешивание растворов с кровью осуществляется
осторожным покачиванием стекол. Оба мазка инкубируют в термостате при
температуре 37°С в течение 15 минут, затем охлаждают мазки на воздухе, а
излишек крови осторожно удаляют наклоном стекла под углом 45о. На предметном
стекле остается микролейкоконцентрат, ограниченный хорошо видимыми
контурами капли. Лейкоциты вследствие своих адгезивных свойств прилипают к
поверхности стекла. После высушивания мазки фиксируют в метаноле 3 минуты,
подсушивают и докрашивают ядра клеток (1-3 минуты) в 0,5 %-ном растворе
нейтрального красного приготовленного на забуференном физиологическом
растворе рН= 7,0. Затем тщательно промывают и хорошо высушивают на воздухе и
микроскопируют при увеличении (90×15) с использованием иммерсионной
системы.

85.

Факультет ветеринарной
медицины
Результаты реакции: формазан-позитивные гранулы окрашиваются в синий цвет, ядра
- в красный. Подсчитывается процент формазан-позитивных нейтрофилов - гранулы
красителя занимают не менее 1/4 части цитоплазмы. Рассчитывают средний
цитохимический индекс (СЦИ) и коэффициент мобилизации (КМ).
Средний цитохимический индекс расчитывают по формуле:
где a, b, c, d, e – количество НГ соответственно 0, 1, 2, 3, 4 степени.
0 а 1b 2c 3d 4e
СЦИ
,
100
Выведение коэффициента мобилизации (КМ) осуществляют по следующей формуле:
КМ
%формазан позитивных НГ в стимулированных NBT
%формазан позитивных НГ в спонтанном NBT

86.

Факультет ветеринарной
медицины
Определение NBT –теста нами разработано, также в молоке, в молозиве, в маточной
слизи или лохиях после родов на 5 –7 сутки у крупного рогатого скота.
Заключение. При необходимости экспресс диагностики иммунного статуса в
качестве ориентировочных тестов, позволяющих оценить грубые дефекты в
иммунной системе, рекомендуются следующие тесты определения количества
нейтрофильных гранулоцитов - Т-, В-, NK- клетки; бактериальный фагоцитоз и
NBT-сп. и NBT-ст. - тесты по выше описанным методикам.
Комплексное исследование состояния микробицидных систем нейтрофилов у
стельных животных, а также молодняка имеет важное значение для своевременного
предупреждения различных заболеваний, предродовой и послеродовой патологии.
Уточнение уровня повреждения нейтрофильных гранулоцитов дает возможность
проведения полноценной иммунокоррекции в сочетании с базисной терапией
основного заболевания, что улучшает результаты лечения и прогноз.

87. Благодарю за внимание!

Факультет ветеринарной
медицины
Благодарю за внимание!