Общая вирусология

1. ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ

LIVING OR DEAD?
Лектор – к.мед.н.,
доцент Колычева
Наталия
Леонидовна

2. Вирусология – наука о вирусах

12 февраля 1892
Д. И. Ивановский открыл
вирус табачной мозаики (ВТМ)

3. История открытия первых вирусов

вирус табачной
мозаики
Ивановский – 12
февраля 1892 г.
2. вирус ящура
Леффлер и Фрош –
1898 г.
3. вирус жёлтой
лихорадки
Рид – 1901 г.
4. вирус саркомы кур
Раус – 1911 г.
5. бактериофаг
д’Эррель – 1917 г.
1.
Установил, что возбудитель мозаичной болезни
табака, в отличие от бактерий, невидим в
микроскоп при самом сильном увеличении,
проходит через фарфоровые фильтры и не
растет на обычных питательных средах.
Обнаружил в клетках больных растений
кристаллические включения («кристаллы
Ивановского»), открыв, таким образом, особый
мир возбудителей заболеваний
небактериальной и непротозойной природы,
названных впоследствии вирусами. Ивановский
рассматривал их как мельчайшие живые
организмы.

4.

Роль вирусов в истории
человечества
"Virus" is from the Greek meaning for "poison" and was initially described by Edward Jenner in 1798.
• 95% населения Северной и Южной Америк погибло от
“европейских” вирусов – кори, натуральной оспы
• ХХ-ХХI век – грипп, ВИЧ, HBV, HCV

5.

Термин “вирус” означает “яд”.
Вирусы - это неклеточные системы живых
существ, которые отличаются своими малыми
размерами,
отсутствием
в
вирионе
белоксинтезирующих и энергогенерирующих
систем, а также облигатным внутриклеточным
паразитизмом.
Целая вирусная частица называется
вирионом

6. Основные отличия вирусов от других форм жизни

один тип нуклеиновой
кислоты
2. отсутствие клеточного
строения
-собственного метаболизма
-белоксинтезирующих систем
-энергозапасающих систем
3. возможность интеграции в
клеточный геном и
синхронной с ним
репликации
4. разобщённый
(дисъюнктивный) способ
размножения (репликации)
1.
ВИРУСЫ СУЩЕСТВУЮТ на
границе между миром
живым и неживым

7. Sizes of selected virions

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Figure 13.4

8.

Нет
пептидогликана
Экстремально
галофильные
(12-32% NaCl)
Термоацидофи
льные-растут
при 75-90С и
низком рН
Патогенных для
человека видов
нет

9. Формы вируса

Вирион
Внеклеточная форма
• Мелкие (17-25 нм)
• Полиомиелит
• Средние (80-120 нм)
• Грипп
• Крупные (300-400 нм)
• Оспа
Вирус
Внутриклеточная форма

10. Формы существования вирусов

внеклеточная
внутриклеточная
(вирион)
(вирус)
НК
капсид
[суперкапсид]
только НК
Близкие к вирусам инфекционные агенты
если НК + белок = вирус, то:
1. только НК = вироид,
2. только белок = прион.

11. Viroids

Small, circular
RNA molecules
without a protein
coat
Infect
plants
11

12. Прионы и медленные инфекции prion = proteinaceous infectious (particle) прион = белковая инфекционная (частица)

Формы существования прионового белка
PrPC (Prion Protein of Cell)нормальная форма
PrPC
(PrPC)
PrPSc
(PrPSc)
PrPSc (Prion Protein
of screpi)патологическая
форма

13. Prions

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

14.

*Медленные инфекции:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
отличительные признаки
Необычно продолжительный (годы)
инкубационный период
Медленно прогрессирующий характер течения
Необычность поражения органов и тканей
Необратимые поражения ЦНС
Неизбежность смертельного исхода
Практически полное отсутствие значимых
иммунных реакций
Формирование в ткани мозга амилоидных
скоплений
Генерализованная гипертрофия астроцитов
Выраженная губчатая дегенерация

15. Принцип строения вирусов

простой (<60 субъединиц белка)
НК + капсид
ПРОСТОЙ
СЛОЖНЫЙ
ВИРУС
сложный (>60)
(по 2, 3 или 5 полипептидов =
капсомер)
спиральная
тип симметрии
+ суперкапсид
кубическая

16. Вирусы

Простые
Содержат
Нуклеиновую
• кислоту.
Белок.
Сложные
Содержат
• Нуклеиновую
кислоту.
• Белок.
• Углеводы.
• Липиды.
• Компоненты клетки
хозяина
(суперкапсид).

17. Virions, complete virus particles

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Figure 13.1

18. Enveloped viruses

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Figure 13.7

19.

20. СПИРАЛЬНЫЙ ТИП СИММЕТРИИ

Вирусы с этим типом симметрии имеют нуклеокапсид трубчатой формы и состоят из НК,
окруженной тесно прилегающими капсомерами.

21.

* Кубический
(икосаэдрический) тип
симметрии
*Вирусы
с кубическим
типом
симметрии
имеют капсид в виде
икосаэдра
(двадцатигранника), в
средине
которого
содержится НК или
нуклеопротеид.

22. ICOSAHEDRAL SYMMETRY

Helical
symmetry
22

23.

Icosahedral
Helical
*
Naked capsidбезоболочечные,
голые вирусы
Lipid
Matrix
Glycoprotein
Enveloped –
оболочечные,
сложные вирусы

24. Icosahedral naked capsid viruses

Adenovirus
Electron micrograph
Foot and mouth disease virus
Crystallographic model

25. Helical naked capsid viruses

RNA
Tobacco mosaic virus
Electron micrograph
Protein
Tobacco mosaic virus
Model

26. Комбинированный тип симетрии

• Вирусы с
комбинированным типом
симметрии имеют
нуклеокапсид,
характеризующийся
кубической симметрией,
а расположенный внутри
нуклеопротеид уложен
спирально

27. ФОРМА ВИРУСОВ

• шаровидная (грипп), палочковидная (бешенство),
нитевидная (филовирусы), кубическая (оспа) и
сперматозоидная (бактериофаг).

28. Принцип строения суперкапсида

гликопротеины
(шипы, ворсинки)
матричный белок
билипидный
слой
Matrix
Lipid
Glycoprotein

29. Структура суперкапсида вируса гриппа

суперкапсид
– М-белок
– билипидный слой
– шипы
(гликопротеины –
gp)
• гемагглютинин (НА)
– адсорбция к
эпителию-связь с
сиаловой к-той,
индукция
вируснейтрализиру
ющих Ig
• нейраминидаза
(NА) – отрыв при
отпочковывании
HANA
Вход
16 подтипов
Выход
9 подтипов

30.

КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ
• Сначала ее пытались построить на основе симптомов
заболеваний (пример-гепатиты)
• Потом на основе сходства в нахождении в организме
(миксовирусы)
• Наконец – на основе строения вириона
• И все неудачно!
Основные признаки, используемые для
современной классификации вирусов
1.
2.
3.
4.
5.
тип нуклеиновой кислоты
структура генома – количество нитей (цепочек)
целостность или фрагментированность генома
наличие суперкапсида
наличие обратной транскриптазы (для отнесения
к семейству ретровирусов)

31.

Baltimore classification
I: dsDNA viruses (e.g. Adenoviruses,
Herpesviruses, Poxviruses)
II: ssDNA viruses (+)sense DNA (Parvoviruses)
III: dsRNA viruses (e.g. Reoviruses)
IV: (+)ssRNA viruses (+)sense RNA (e.g.
Picornaviruses, Togaviruses)
V: (−)ssRNA viruses (−)sense RNA (e.g.
Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses)
VI: ssRNA-RT viruses (+)sense RNA with DNA
intermediate in life-cycle (Retroviruses)
VII: dsDNA-RT viruses (e.g. Hepadnaviruses)

32. Иерархическая система таксонов, применяемых в вирусологии

Царство
1.
Vira
Подцарство
2.
–
–
3.
ДНК-геномные вирусы
РНК-геномные вирусы
Семейство
Название таксона заканчивается на –viridae
4.
Подсемейство
Название таксона заканчивается на –virinae (существует у
некоторых семейств)
5. Род
Название таксона заканчивается на –virus. Основной таксон в
классификации вирусов
6. Вирус
7. Серовары
По антигенной структуре

33.

virus classification: DNA Viruses
Family
Pox
Genome
<---------------------------------------ds DNA-------------------------------------->
Capsid
symmetry
Complex
Envelope
<-----------------Yes------------------>
e.g.
Vaccinia virus
Molluscum
Contagiosum
Herpes
Adeno
Papova
Parvo
Hepadna
ssDNA
Partial dsDNA
<---------------------------------------------Icosahedral-------------------------------------------------->
Herpes simplex
virus 2
<-----------------------------No------------------------------>
Human
adenovirus
Papilloma
AdenoAssociated
Yes
Hepatitis B

34.

Plus Sense RNA Viruses
Plus-sense RNA viruses
Family
Genome
Corona
Toga/Flavi
Picorna
Calici
<-------------------------------------------ss (+) RNA--------------------------------------------->
Capsid symme try
Helical
Envelope
e.g.
<----------------------Yes-------------------->
Human corona
Rubella virus
virus
Hepatitis C vi rus
Retro
Diploid ( +) RNA
<--------------------------------------Icosahedral------------------------------------------------->
<---------------------No---------------------->
Polio
Norwalk agent
Hepatitis A vi rus
Hepatitis E virus
Yes
HIV-1

35.

Minus Sense RNA Viruses
Minus-sense RNA viruses
Family
Genome
Paramyxo
Rhabd o
Filo
<-----------------ss(-) RNA------------------------>
Capsid
symmetry
Envelope
Orthomyxo
Arena
Bunya
ss(-) RNA
ss(+) or (+/-) ss(+) or (+/-)
segments
segments
segments
<---------------------------------------------------Helical------------------------------------------------------->
Reo
ds RNA
segments
Icosahedral
<----------------------------------------------------Yes----------------------------------------------------------->
No
Measles
Mu mps
Parainfluenza
Rotavirus
e.g.
Rabies virus
Ebola virus
Influenza
virus
Lassa virus
Hanta virus

36. Размеры вирионов

15-18 нм – 300-400
нм
1. мелкие: <40 нм
– ДНК
• Parvo– РНК
• Picorna• Calici2. средние: 40 –
130 нм
3. крупные: >130
нм
– ДНК
• Pox• Herpes– РНК
• Paramyxo
• Rhabdo• Arena-

37.

* Общая
характеристика
ДНК вирусов
*форма:
*линейная
*кольцевая
*на концах –
идентичные
повторы:
*маркеры вирусной
(не клеточной)
ДНК
*способны
замыкать ДНК в
кольцо
* репликация
* транскрипция
* устойчивость к
клеточным
эндонуклеазам
* интеграция в
клеточный геном
Общая характеристика
РНК вирусов
• форма:
– линейная
– кольцевая
• структура:
– цельная
– фрагментированная
• информационная функция:
+нить (позитивный геном) =
иРНК сразу может
транслироваться без
транскрипции
-нить (негативный геном) ≠
иРНК сначала транскрипция,
потом трансляция

38.

1.
2.
* Общая характеристика белков
Структурные
вирусов
* капсидные
* «внутренние», гистоноподобные (НК
рибо/дезоксирибонуклеопротеин)
Функциональные (ферменты)
* вирионные
* вирусиндуцированные
* вирус может модифицировать клеточные ферменты
Строгий цитотропизм вирусов
Способность вирусов к репликации только в строго
определённых клетках и органах
• поражаемая клетка должна иметь соответствующие
данному вирусу:
– рецепторы для адсорбции
– ферменты депротеинизации

39. Репродукция вирусов

*Репродукция вирусов
1. Адсорбция вируса на поверхности клетки
2. Проникновение внутрь
3. «Раздевание» вирионов
4. Синтез компонентов вириона
5. Сборка вириона
6. Выход вириона из клетки

40. Виропексис (на примере вируса гриппа) НА-сиаловая к-та

Способы проникновения вирусов в клетки
1. Виропексис (рецепторный эндоцитоз)
2. Слияние мембран
3. Прямая пенетрация
Виропексис (на примере вируса гриппа)
НА-сиаловая к-та
Слияние мембран (на примере ВИЧ)
gp120-CD4

41.

*Депротеинизация
вирусов
Освобождение нуклеиновой кислоты
путём сброса вирусом белковой (-ых)
оболочки (-чек)
1. При виропексисе – в эндоцитозном
пузырьке (у сложных – может
завершаться при проникновении в
ядро клетки)
2. При слиянии мембран –
одновременно с проникновением

42. Центральная догма молекулярной биологии — обобщающее наблюдаемое в природе правило реализации генетической информации: информация пере

Центральная догма молекулярной биологии — обобщающее наблюдаемое в
природе правило реализации генетической информации: информация
передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении.
3 класса способов передачи информации, описываемые догмой
Общие
ДНК → ДНК
(репликация)
ДНК → РНК
(транскрипция)
РНК → белок
(трансляция)
Специальные
(у вирусов)
Неизвестные и
малоизученные
РНК → ДНК
белок → ДНК
РНК → РНК
белок → РНК
ДНК → белок
белок → белок
(прионы)

43.

*
1.Транскрипция и трансляция вирусного генома
ДНКвирусы
ДНК
мРНК
белок
-нить
РНК
мРНК
белок
РНК-вирусы
+нить
РНК
белок
RetroРНК
ДНК
РНК
белок
Синтез ранних и поздних белков
ранние > репликация НК > поздние

44. РАЗНООБРАЗИЕ РАЗМЕРОВ ГЕНОМОВ.

Arabidopsis thaliana 21000 генов.
ДНК-ВИРУСЫ.
(двунитевые ДНК)
Mimivirus (mimicring microbes).
Ø 400 nm+80nm;
>1000 генов; 500 млн.Da, 1182 kbp .
Вирус оспы
150- 300 генов; 160млн.Da, 150-300 kbp.
Бактериофагаг Т4 300 генов; 120 млн. Da, 169 kbp.
Вирус герпеса 70 генов; 100млн.Da, 120 kbp.
Аденовирус
40 генов; 25 млн. Da, 26-46 kbp.
Папиллома 8 генов;
3.2 млн. Da, 7.0-8.4 kbp.
Однонитевые ДНК:
Бактериофаг М13 -10 генов;
8 kb.
Парвовирус –
6 генов;
1.5 млн. Da; 5 kb.

45. РАЗНООБРАЗИЕ РАЗМЕРОВ ГЕНОМОВ (РНК-вирусы)

Коронавирус 7 генов;>30 млн.Da, 30 kb.
ВТМ3-4 гена;2 млн. Da, 6.4 kb.
РНК-фаг 4 гена; 1.5 млн.Da, 3.4-4.2 kb.
Астровирусы - 2 гена; 1 млн. Da, 6-7 kb.
Нарнавирусы – кодируют 1 белок; геном20S РНК,
2.3-3.0 kb.

46.

*Исходы вирусной
инфекции клетки
НК вируса в клетке
интеграция в
геном
опухоль
латентная
инфекция
плазмида
опухоль
продуктивная
инфекция
латентная
лизис
инфекция
выделение
без
лизиса

47.

ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИКИ
ВИРУСОВ
1. Генетическая
рекомбинация
2. Генетическая
реактивация
3. Комплементация
4. Фенотипическое
смешивание
обмен
генетическим
материалом
нет обмена
генетическим
материалом

48. Генетическая реактивация

вирус 1 + вирус 2 в одной клетке
вирус 1
вирус 2
(инакт. гены 1, 2, 3) (инакт. гены 4, 5, 6)
вирус
(все гены 1 – 6 активированы)
Наблюдается между геномами родственных вирусов, имеющих
мутации в разных генах. В результате перераспределения генетического
материала формируется полноценный дочерний геном

49. Комплементация

вирус 1 + вирус 2 в одной клетке
вирус 1
белок
репродукция вируса 2
Один из вирусов (2) синтезирует нефункциональный
белок в рез-те мутации. Немутантный вирус (1), синтезируя
полноценный белок, восполняет его отсутствие у мутантного
вируса

50. Фенотипическое смешивание

вирус 1 + вирус 2 в одной клетке
вирус 1
вирус 2
НК 1
капсид 2
При смешанном заражении клетки двумя вирусами часть потомства
приобретает фенотипические признаки, присущие двум вирусам, при сохранении
неизменности генотипа

51.

*Особенности вирусных
1. возможность интегративной
инфекций
инфекции (вирогении)
2. стадия вирусемии (кроме вирусов,
распространяющихся нейрогенным
путём)
3. поражение иммунокомпетентых
клеток иммунопатологические
состояния
4. м.б. пожизненная персистенция

52.

* Механизм опосредования
инфекционности вирусов
На клетки:
*цитопатическое
действие – повреждение
клеток вплоть до их
гибели
*иммуноопосредованное
поражение –
аутоиммунная реакция
На организм:
*иммунотропное действие –
поражение ИКК
*толерогенное действие –
индуцирование
иммунологической
толерантности
*онкогенное действие –
индуцирование опухолевого
перерождения
*тератогенное действие –
поражение плода

53. Действие факторов противовирусного иммунитета

вирион
проникновение
в клетку
Ig
Действуют
только вне
клетки
инфицированная
клетка
NK
ЦТЛ (Tk)
ИФН
проникновение в
соседние клетки

54.

* Методы диагностики
вирусных инфекций
1.Цитологический
2.Вирусологический
3.Серологический
4.Молекулярногенетический

55.

Культивирование вирусов
Куриные эмбрионы 612 дневного
возраста.
Способы заражения открытый, закрытый

56. Inoculation sites for the culture of viruses in eggs

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.
Figure 13.18

57.

Культивирование вирусов
Культуры клеток: - первично-трипсинизированные
культуры эмбрионов человека, почек мартышек,
фибробластов эмбриона курицы и тому подобное;
способные расти на протяжении нескольких пассажей как вторичные культуры; перевиваемые
клетки; они представляют собой культуры клеток,
которые приобрели способность к неограниченному
росту и размножению; Их получают из опухолей или
из нормальных человеческих или животных тканей,
которые имеют измененный кариотип. HeLa
(карцинома шейки матки) Hep-2 (карцинома
гортани человека), КВ (карцинома ротовой полости
человека), RD (рабдомиосаркома человека), RH
(почка эмбриона человека), Vero (почка зеленой
мартышки), СПЭВ (почка эмбриона свиньи), ВНК32 (почка сирийского хомяка)
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

58.

Культуры клеток
диплоидные клетки; они представляют собой
культуры клетки одного типа, имеют диплоидный набор хромосом и способные выдерживать
при этом до 100 пересеваний в условиях лаборатории. Они являются удобной моделью для
получения вакцинных препаратов вирусов, так
как свободные от контаминации инородными
вирусами, хранят исходный кариотип во время
пассажей, не имеют онкогенной активности.
Чаще всего пользуются линиями культур,
которые получены с фибробластов эмбриона
человека (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), коров,
свиней, овец и тому подобное. Культуры клеток
хранят в замороженном состоянии.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

59.

Питательные среды, которые используются для
поддержки культур клеток или их роста бывают
естественными или синтетическими
(искусственными).
Естественные среды - сыворотка крови крупного
рогатого скота, жидкости из серозных полостей,
продукты гидролиза молока, многообразные
гидролизаты (5 % гемогидролизат, 0,5 % гидролизат
лактоальбумина) или экстракты тканей. Их
химический состав помогает создать условия, какие
подобные к тем, что существуют в организме
человека. Существенным недостатком таких сред
считается их нестандартность, ведь качественный и
количественный состав компонентов, которые входят
к их составу, может изменяться.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

60.

Синтетические питательные среды не имеют этого
недостатка, ведь их химический состав стандартен,
потому что их получают комбинируя многообразные
солевые растворы (витамины, аминокислоты) в
искусственных условиях. К таким наиболее
употребимым растворам принадлежат среда 199
(культивирование первинно-трипсинизированных и
перевиваемых культур клеток), среда Игла (содержит
минимальный набор аминокислот и витаминов и
используется для культивирования диплоидных
линий клеток и перевиваемых), среда Игла МЕМ
(культивирование особенно требовательных линий
клеток), раствор Хенкса, что используется для
изготовления питательных сред, отмывания клеток и
тому подобное.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

61. Культивирование вирусов

Виды культур клеток
• Неперевиваемые клетки (in vitro не
размножаются).
• Полуперевиваемые клетки (50 генераций).
• Перевиваемые (раковые клетки или
нормальные клетки зародыша).
Критерии:
• Цитопатическое действие (ЦПД)
• Включения
• Образование бляшек
• Гемадсорбция
• “Цветная” проба.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

62.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

63.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

64.

Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

65.

Цитопатическое действие
1. Полная дегенерация клеточного монослоя.Отдельные клетки,
которые остаются живыми, изменяют свою морфологию, у них
заметный пикноз ядра и цитоплазмы (пикорнавирусы -вирусы
полиомиелита Коксаки, ЕСНО).
2. Симпластообразующий тип ЦПД (возбудители кори,
эпидемического паротита, парагриппа, респираторносинцитиальных вирусов). Возникают многоядерные гигантские
клетки (симпласты или синцитии).
3. Круглоклеточная дегенерация (аденовирусы).
При репродукции риновирусов образуются округлые клетки,
которые имеют отростки, а при размножении герпесвирусов
наблюдается формирование подобных клеток одинакового размера,
которые разбросаны по всему монослою.
4. Пролиферативный тип изменений (онкогенные вирусы) формирование нескольких слоев клеток.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

66.

Заражение лабораторных животных.
Многочисленные лабораторные животные широко
используются в вирусологии для выделения и
идентификации вирусов, получения специфических
противовирусных сывороток, изучения
многообразных аспектов патогенеза вирусных
заболеваний, разработки способов борьбы с
заболеваниями и их профилактики. Чаще всего
используют белых мышей разного возраста
(двухдневного возраста), белых крыс, гвинейских
свинок, кролей, сусликов, хлопчатниковых крыс,
мартышек и других.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

67.

Существуют многообразные способы заражения
животных в зависимости от тропизма вирусов,
клинической картины заболевания и тому подобное.
Исследуемый материал можно вводить:
- через рот
- в дыхательные пути (ингаляторно, через нос)
- накожный
- внутрикожно
- подкожно, внутримышечный
- внутривенно
- внутрибрюшинно
- внутрисердечно
- на скарифицированную роговицу
- в переднюю камеру глаза
- в мозг.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

68.

Для выделения вирусов простого герпеса,
натуральной оспы используют заражение
лабораторных животных (кроликов) на
скарифицированную роговицу глаза.
При исследовании вирусов гепатита А вводят
исследуемый материал через рот.
При выделении вирусов с нейротропными
свойствами, таких как арбовирусы, вирусы
бешенства, полиомиелита, Коксаки целесообразно
заражать белых мышей (1-2-дневных сосунков) в
мозг.
Copyright © 2011 Pearson Education Inc.

69.

PLAQUE ASSAY
69

70.

PLAQUE ASSAY
70

71.

PLAQUE ASSAY
71

72. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Цели
• обнаружение в патологическом
материале конкретного вида
микроорганизма без выделения
чистой культуры
• идентификация микроорганизмов
• генотипирование микроорганизмов
Праймеры для ПЦР
Праймер (англ. primer) — это короткий фрагмент НК, который
служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры
необходимы ДНК-полимеразам, так как ДНК-полимеразы могут
только наращивать существующую цепь.
• Создание своих праймеров
• Программы: PrimerSelect (DNASTAR), Oligo
• Необходимо знать последовательность (генбанк)

73. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Принцип осуществления
патологический материал или штамм микроорганизма
выделение ДНК
нагрев
расплетение ДНК на две нити
добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’концам искомого гена)
охлаждение
связывание праймеров с комплементарными участками искомого
гена

74. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Принцип осуществления
добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов
нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров
повторение циклов (30-80) – накопление (амплификация)
искомого гена
резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества
искомого гена
определение количества ДНК с помощью электрофореза
+ количество ДНК увеличивается
– количество ДНК не увеличивается

75.

Выделенная ДНК
Буфер
Mg
dNTPs (dA, dC, dT, dG)
Термостойкая ДНКполимераза –
-Taq-полимераза Thermus aquaticus
-Pfu-полимераза Pyrococcus furiosus
-Pwo-полимеразаPyrococcus woesei
• Праймеры («туда и
обратно») –
cпецифичность
реакции
• Амплификатор