Молекулярный фишинг на чипе оптического биосенсора

1. Молекулярный фишинг на чипе оптического биосенсора

2. Оптический биосенсор

Оптический биосенсор, основанный на
эффекте
поверхностного
плазмонного
резонанса
(SPR),
используется
для
количественных измерений ББВ.
SPR позволяет регистрировать ББВ в
реальном времени в виде сенсограмм .

3. Принцип работы оптического биосенсора на эффекте SPR

4.

5.

Анализ серии сенсограмм, полученных при
разных концентрациях аналита:
• равновесные
характеристики
межмолекулярных
взаимодействий
—
константу
диссоциации
комплекса
и
аффинность
• кинетические параметры — константы
скоростей образования и распада белковых
комплексов
Анализ серии сенсограмм, полученных при
разных температурах:
• термодинамические
характеристики
—
изменение свободной энергии Гиббса (ΔG),
изменение энтальпии (ΔH) и энтропии (ΔS)

6. Принципы иммобилизации лигандов на поверхности оптических чипов

ковалентная
иммобилизации
лигандов
нековалентная
иммобилизация
лигандов

7. Принцип нековалентной иммобилизации

На поверхности оптического чипа ковалентно закрепляется
специфический аффинный реагент, на который нековалентно
иммобилизируется лиганд (рис. б). В качестве такой аффинной связки
могут выступать специфические моно- или поликлональные антитела,
стрептавидин .
Распространен метод иммобилизации белков лигандов, содержащих
так называемый гистаг (метку в виде последовательности из 6
гистидинов, 6×His). Белки иммобилизуются на оптическом чипе,
поверхность
которого
модифицирована
соединением
NTA
(нитрилотриацетат), за счет образования трех хелатных комплексов,
состоящих из двух остатков гистидина, одного иона никеля (Ni2+) и
одной молекулы NTA (рис. в)

8.

Оптический
биосенсор
не
осуществляет
идентификацию выделенных белков, поэтому он
используется совместно с масс-спектрометрической
идентификацией.
Идентификация белковых последовательностей
при
помощи
комбинации
высокопроизводительных методов разделения
белков и их масс-спектрометрического анализа
является ключевым этапом протеомного
анализа.

9.

Методы, используемые в современных протеомных
исследованиях, основаны на трех технологических
платформах:
• Использование
двумерного
электрофореза
в
комбинации с идентификацией белков методом
MALDI-TOF масс-спектрометрии.
• Использование одномерного электрофореза в
полиакриламидном геле в комбинации с обращеннофазовой жидкостной хроматографией, совмещенной
с тандемной масс-спектрометрической детекцией.
• Использование безгелевой технологии MudPit при
помощи
многомерного
хроматографического
разделения
белков
с
последующим
массспектрометрическим анализом

10. Двумерный электрофорез

- метод разделения, основанный на последовательном
использовании двух свойств белков: заряда и массы.
Для визуализации белковых молекул используют различные
методы их окрашивания - методы серебрения, окраски Кумасси
голубым и флуоресцентные красители.
Для изучения белковых комплексов используется нативный
(неденатурирующий) 2DE или голубой нативный 2DE.
Для
осуществления
идентификации
представленные
на
электрофореграмме в виде пятен белки вырезают, и затем
проводят ферментативное расщепление белка в пятне с
использованием трипсина.
Полученный
гидролизат
анализируют
при
помощи
массспектрометрии.
Идентификация белков по полученным масс-спектрам пептидных
фрагментов проводится с использованием баз данных белковых и
нуклеотидных последовательностей.

11. Одномерный электрофорез

• Белки, разделенные методом одномерного
электрофореза,
также
подвергают
триптическому гидролизу в геле.
• Затем
экстрагированные
пептиды
анализируют с использованием массспектрометрических подходов.

12. Безгелевые технологии

• многомерное
разделение
пептидов,
полученных при гидролизе тканей или
клеток.
Этапы: - гидролиз белков в смеси
- первое направление разделения
пептидов