Полимеразная цепная реакция. Теория и практика

1. Полимеразная цепная реакция Теория и Практика

Лукашенко Е.В.
Заведующая ООО «Экспертная лаборатория»

2. Методы лабораторной диагностики

Прямой (АГ)
Бактериология
Гистология
Вирусовыделение
Серология (АГ)
ПЦР
Непрямой (АТ)
Гистология
Серология (АТ)

3. Полимеразная цепная реакция

Разработана Кэрри Мюллисом 1983 г.,
Нобелевская премия 1993 г.
Это метод амплификации in vitro, с помощью
которого в течение нескольких часов можно
выделить и размножить определенную
последовательность нуклеиновой кислоты в
количестве, превышающем исходное в
миллионы раз
ПЦР- селективная амплификация
(клонирование) фрагмента ДНК in vitro
3

4.

Этапы полимеразной цепной
реакции
1. Преаналитический
этап
2. Амплификация
(аналитический этап)
Отбор материала
Подготовка материала
Пробоподготовка
Выделение
генетического
материала
Амплификация
Транспортировка

5. Выделение генетического материала

Выделение НК - процедура подготовки
пробы включает лизис микроорганизма
и экстракцию нуклеиновой кислоты с
удалением ингибиторов.
Система для выделения генетического
материала подбирается под
исследуемый биоматериал, также
учитываются особенности искомого АГ.
5

6. Полимеразная цепная реакция

Амплификация – процесс многократного
копирования определенного фрагмента
ДНК
6

7. Этапы амплификации (1 цикл)

8. Необходимые компаненты ПЦР

• Специфические праймеры
• Нуклеотиды
• Реакционный буфер
• ДНК биоматериала
Праймеры – основа ПЦР и ее
специфичности

9. ПЦР в «реальном времени»

Праймер + меченый флюорохромом зонд
Накопление продуктов ПЦР
Накопление флуоресцентного сигнала
Регистрация флуоресцентного сигнала в
режиме реального времени
9

10. Результаты амплификации

Сt – «пороговый цикл» – выход
положительного образца
Базовая линия (Threshold)
Сt
Threshold
10

11. Результаты амплификации

Накопление сигнала
Зона роста
Рост
Участок насыщения (плато)
11

12. Контроль качества ПЦР

Положительный контроль (ПКО)– всегда
положительный
Отрицательный контроль (ОКО)– всегда
отрицательный (если нет ВКО)
Внутренний контроль (ВКО)
12

13. Классификация ВКО

Внутренний контроль образца
1. Контроль выделения или контроль
амплификации
2. Эндогенный – фрагмент
генетического материала хозяина
3. Экзогенный – добавляется в
исследуемый материал
ВКО всегда положительный!
13

14. Материал для ПЦР

FTA-карты (мазки отпечатки органов мишеней)
Органы и ткани
Мазки и соскобы (свобы)
Сыворотка крови
14

15. Материал для ПЦР

• FTA-карты (мазки отпечатки органов мишеней)
• Каждая мишень имеет номер и обозначение
• ФТА-карта в отдельной упаковке
15

16. Материал для ПЦР

Болезнь Ньюкасла: Селезенка, трахея,
илеоцекальные железы, почки и мазкиотпечатки этих органов.
Инфекционный бронхит кур: трахея,
легкие, яичники, илеоцекальные железы,
почки и мазки-отпечатки этих органов
Болезнь Гамборо: Фабрициева сумка,
селезенка, лимфоидная ткань и мазкиотпечатки этих органов
16

17. АНАЛИЗ и ОЦЕНКА

1. Особенности животного
(возраст, физиологический статус, вакцинации и прочее..)
2. Особенности инфекции
3. Тип использованной реакции
4. Особенности диагностического набора

18. Производители ПЦР наборов

ИЛС
BioCheck
Anicon (Kylt)
IDVet
LSI
ИДС
...НЕ МНОГО….ХОРОШИХ….РАЗНЫХ
18

19. Лабораторная диагностика

ОГРАНИЧЕНИЯ:
Особенности целевого микроорганизма
Качество отбора образцов (….несвоевременно)
Качество образцов сывороток крови
Качество используемых тест-систем
Качество интерпретации полученных результатов

20. ВЫВОДЫ

КОМПЛЕКСНО!
• Анамнез
• Эпизоотологическое обследование
• Клиническое обследование
• Патологоанатомическое обследование
• Лабораторные исследования
ДИАГНОЗ

21. Спасибо за внимание!