Полимеразная цепная реакция

1. Полимеразная цепная реакция

2.

ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся стадий:
1. тепловая денатурация исходной ДНК при ~94°С;
2. отжиг ДНК-затравок (праймеров) при ~50-60°С на получившиеся одноцепочечные матрицы;
3. элонгация (синтез двухцепочечных ДНК при 72°С с каждым из праймеров навстречу друг другу по
противоположным цепям ДНК)

3.

4.

5.

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных
экспериментах
Применение ПЦР:
1. амплификация ДНК
2. введение мутаций
3. сращивание фрагментов ДНК
4. в биологической и медицинской практике (диагностика заболеваний (наследственных,
инфекционных), криминалистика, установление отцовства, клонирование генов, выделения новых
генов
Компоненты реакции
1. ДНК-матрица
2. Два праймера
3. Термостабильная ДНК-полимераза (Taq-полимераза из Thermus aquaticus, Pfu-полимераза из
Pyrococcus furiosus, Pwo-полимераза из Pyrococcus woesei, Tth-полимераза из Thermus thermophilus
и др.)
4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
5. Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы
6. Буферный раствор

6.

Праймеры:
1. образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами (18-30 п.н.).
2. Упрощенный расчет оптимальной температуры отжига праймера:
T = [(A+T) x 2°C] + [(G+C) x 4°C] (если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований)
T = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))(если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований)
При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:
1. GC-состав ~40-60%;
2. близкие T отжига праймеров (отличия не более, чем на 5°C);
3. отсутствие неспецифических вторичных структур - шпилек и димеров;
4. на 3’-конце - гуанин (G) или цитозин (C), поскольку они образуют три водородные связи с молекулой
матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

7.

8.

9. Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR) или ПЦР в реальном времени

10.

Этапы для проведения ПЦР в реальном времени
1) Выделение тотальной РНК (рРНК, мРНК, тРНК)
2) Проверка качества тотальной РНК
3) Определение концентрации тотальной РНК (спектрофотометр
NanoDrop ND-1000, “NanoDrop Technologies”, США)
4) Синтез cDNA
5) ПЦР в реальном времени

11.

Выделение тотальной РНК (рРНК, мРНК, тРНК)

12.

Выделение тотальной РНК
Реагент для выделения суммарной РНК ExtractRNA (Евроген)
Преимущества реагента:
Быстрое выделение суммарной РНК высокого качества
ExtractRNA - монофазный водный раствор фенола и гуанидин-изотиоцианата, предназначенный для быстрого
выделения суммарной РНК высокого качества из широкого круга объектов: животные и растительные ткани,
культуры клеток млекопитающих, бактерий, дрожжей.
Добавленный к образцу реагент моментально лизирует клетки, при этом целостность РНК сохраняется за счет
высокоэффективного ингибирования активности РНКаз. В процессе денатурации все клеточные компоненты
переходят в гомогенат, а затем, после добавления хлороформа и последующего центрифугирования, эмульсия
разделяется на водную фазу, интерфазу и органическую фазу, при этом РНК, ДНК и белки оказываются в
разных фазах.
Суммарная РНК, выделенная с помощью реагента ExtractRNA, может быть использована для синтеза кДНК, ОТ-ПЦР,
Нозерн блота, in vitro трансляции, выделения поли (А)+ фракции и других приложений.
Реагент ExtractRNA содержит фенол (токсичное и раздражающее вещество) и гуанидин-изотиоцианат
(раздражающее вещество), при попадании на кожу вызывает ожоги.
Не допускайте попадания реагента на кожу или слизистые оболочки, а также вдыхания его паров!

13.

Необходимые материалы
Хлороформ
Изопропиловый спирт
80% этиловый спирт
Вода, свободная от РНКаз
Центрифуга с охлаждением, обеспечивающая ускорение не менее 12 000 g
Настольный термостат (55-60°C)
Стерильные микроцентрифужные пробирки (1.5-2 мл)
Устройство для разрушения и гомогенизации тканей:
Для замороженных тканей–жидкий азот, ступка с пестиком.
Для свежих или зафиксированных в консервирующих растворах тканей, рекомендуется использовать
гомогенизатор Даунса, шариковый гомогенизатор (бисерная мельница). Также можно измельчить ткани
скальпелем.

14.

Протокол выделения суммарной РНК
1. Гомогенизация пробы
1) Гомогенизируйте образец в растворе ExtractRNA в соответствии с рекомендациями для вашего типа пробы.
2) Инкубируйте лизат при комнатной температуре в течение 10-15 мин, чтобы произошла полная диссоциация
нуклеопротеидных комплексов.
3) Центрифугируйте лизат при 12 000-15 000 g в течение 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов.
Супернатант перелейте в новую пробирку. На поверхности лизата богатых жиром образцов может образоваться
жировая пленка. При отборе супернатанта следует избегать попадания верхнего жирового слоя в новую пробирку.
Лизаты могут храниться при комнатной температуре в течение нескольких часов, при -70°C в течение одного
месяца.
Замороженные лизаты следует размораживать при комнатной температуре. При необходимости, прогрейте образец
при 37°C на водяной бане в течение 5-10 мин до полного растворения солей. Избегайте длительного прогрева
лизатов, это может вызвать деградацию РНК.

15.

2. Разделение фаз
1) Добавьте 0.2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента ExtractRNA, добавленного на этапе гомогенизации
2) Закройте пробирку, активно перемешайте содержимое пробирки с помощью встряхивания (вручную) в течение
15 секунд. Не используйте вортекс
3) Инкубируйте смесь в течение 3-5 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая образец
4) Центрифугируйте образец при 12000 g в течение 15 минут при 4°C.
В ходе центрифугирования произойдет разделение смеси на три фазы: нижнюю – органическую фенолхлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу. РНК
находится в водной фазе, составляющей 45-50% от общего объема смеси.
5) Держа пробирку наклонно (под углом 45°), аккуратно отберите водную фазу, избегая касания интерфазы или
органической фазы. Для получения образцов РНК хорошего качества важно избежать отбора интерфазы.
6) Переместите водную фазу в новую пробирку.
При выделении РНК из небольшого количества образца (менее 10 мг ткани) в водную фазу рекомендуется
добавить 5-10 мкг соосадителя нуклеиновых кислот Satellite Red (Евроген,кат. #BC001). Концентрация соосадителя
не должна превышать 4 мг/мл.

16.

17.

3. Выделение РНК
На этом этапе нужно соблюдать соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения
препарата РНКазами.
1) Добавьте в водную фазу 0.5мл 100% изопропанола на каждый 1мл реагента, использованного для
гомогенизации
2) Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 10 мин.
3) Центрифугируйте образец при 12 000 g в течение 10 мин при комнатной температуре
Понижение температуры может привести к выпадению солей в осадок.
4) Тщательно отберите супернатант, оставив осадок РНК на дне пробирки.
Осадок РНК может быть невидим.
5) Аккуратно, по стенке пробирки, добавьте 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола, использованного
ранее.
Образцы в этаноле могут храниться при -20°C и ниже в течение нескольких лет.

18.

6) Образец центрифугируйте на максимальной скорости в течение 5 мин при комнатной температуре.
7) Удалите этанол.
Внимательно следите, чтобы в процессе отмывки осадок не был смыт со дна пробирки и утерян.
8) Высушите осадок на воздухе в пробирке с открытой крышкой в течении 5-7 мин. Не оставляйте высохший
образец на воздухе слишком долго: пересохший осадок РНК плохо растворяется вводе. Не используйте для
сушки подогрев или вакуумное центрифугирование.
9) Растворите РНК в необходимом объеме свободной от РНКаз воды.
Перемешайте раствор пипетированием для лучшего растворения осадка. Встряхните раствор на вортексе,
сбросьте капли центрифугированием.
Для улучшения растворения образец рекомендуется прогреть при 55-60°Cв течение 3-5 минут.
10) Заморозьте образец.
Выделенная РНК может сразу же быть использована для любых приложений. Все дальнейшие работы с
препаратом следует вести на льду. Перед длительным хранением препарат РНК рекомендуется распределить на
аликвоты и заморозить. Замороженная РНК хранится при температуре -20°C и ниже в течение 1 года. Избегайте
избыточных циклов замораживания-размораживания образца.
При использовании пробы для любых ПЦР-анализов следует учитывать, что фракция РНК всегда содержит
примесь геномной ДНК. В ряде случаев образец РНК следует дополнительно обработать ДНКазой, свободной от
РНКазной активности.
Ожидаемый выход РНК.
Из 1 мг ткани млекопитающих можно получить от 1 до 10 мкг РНК.
Стандартная процедура выделения с применением ExtractRNA рассчитана на небольшое количество стартового
материала (до 50 мл суспензии клеток или 5 мг ткани), однако, в случае необходимости, операции могут быть
масштабированы для обработки большого количества исходного материала.

19.

20.

Проверка качества тотальной РНК
Рекомендуются следующие условия гель-электрофореза:
1. 1X TAE буфер (Трис-ацетатный-ЭДТА буфер — буферный раствор, содержащий трис, уксусную кислоту и
ЭДТА)
Состав Трис-ацетатного буфера (10Х) – 400 мМ Трис (121,14 г/моль), 200 мМ уксусная кислота (60,05
г/моль) и 10мМ ЭДТА (292,2438 г/моль)
- агарозный гель в концентрации 1,1% -1,2%
- добавить этидийбромид (EtBr) в гель и буфер для электрофореза (Надевайте перчатки, чтобы защитить
образцы РНК от деградации нуклеазами и избегать контакта рук с EtBr).
2. Нагрейте аликвоту раствора РНК при 70°С в течение 1 мин и поместите его на лед перед загрузкой в ​гель.
3. Загрузите известное маркер и образцы в горизонтальный агарозный гель
Успешное получение РНК:
- Для суммарной РНК млекопитающих следует наблюдать две интенсивные полосы около 4,5 и 1,9 т.п.н. Эти
полосы представляют 28S и 18S рРНК. Соотношение интенсивностей этих полос должно быть около 1,5-2,5

21.

22.

Определение концентрации тотальной РНК
(спектрофотометр NanoDrop ND-1000, “NanoDrop Technologies”, США)

23.

Синтез кДНК
Обратная транскриптаза MMLV
Обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей (MMLV ревертаза) предназначена для синтеза первой
цепи кДНК с одноцепочечной РНК-матрицы. Фермент получен из рекомбинантного штамма Е. coli,
экспрессирующего ген MMLV ревертазы дикого типа.

24.

Протокол проведения обратной транскрипции с использованием MMLV ревертазы
1. Приготовьте смесь следующих компонентов в стерильной
пробирке:
Х мкл
1-6 мкл
1-3 мкл
9 мкл
стерильная вода, свободная от РНКаз
РНК матрица (0.5-2 мкг)
праймер OligodT (20 мкМ)
суммарный объем первой части реакционной смеси
2. Аккуратно перемешайте смесь, сбросьте капли со стенок на микроцентрифуге
3. Прогрейте смесь 2 мин при 70°C для расплавления вторичных структур РНК и перенесите образцы
в лед. Сбросьте капли реакционной смеси со стенок пробирки на микроцентрифуге
4. Добавьте 11 мкл предварительно подготовленной смеси следующего состава:
Х мкл
Стерильная вода, свободная от РНКаз
4 мкл
5х буфер для синтеза первой цепи
2 мкл
смесь dNTP (10 мМ каждого)
2 мкл
DTT (20 мМ)
1-3 мкл MMLV ревертаза (добавить в последнюю
очередь!)
11 мкл Суммарный объем второй части реакционной смеси
5. Аккуратно перемешайте смесь, сбросьте капли со стенок на микроцентрифуге
6. Инкубируйте реакционную смесь 30-60 мин при 37-42°C
7. Для остановки реакции прогрейте смесь при 70°C в течение 10 мин

25. ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени проводят на амплификаторе ДТ-322 (“ДНК-Технология”, Россия) c использованием
Taq-ДНК-полимеразы (“Евроген”, Россия) и SYBR Green I (“Invitrogen”) в качестве флуоресцентного
красителя.
Интеркалирующий краситель SYBR Green I для ПЦР-РВ (Евроген)
SYBR Green I – интеркалирующий краситель, специфичный к двухцепочечной ДНК. Раствор оптимизирован
для применения в ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Принцип действия
SYBR Green I – интеркалирующий краситель, интенсивность флуоресценции которого увеличивается на
несколько порядков при встраивании в двухцепочечную ДНК. Поэтому в ходе ПЦР при накоплении
продукта амплификации сигнал флуоресценции возрастает, образуя кривую сигмоидной формы

26.

Готовая смесь для ПЦР qPCRmix-HS SYBR
-5X готовая реакционная смесь для ПЦР с красителем SYBR Green I
- Горячий старт в первом цикле денатурации
5X реакционная смесь qPCRmix-HS SYBR предназначена для высокоспецифичной ПЦР в реальном времени
с интеркалирующим красителем SYBR Green I.
qPCRmix-HS SYBR подходит для real-time амплификаторов любого типа.
В состав qPCRmix-HS SYBR входят следующие компоненты: HS Taq ДНК полимераза, краситель SYBR
Green I, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, Mg2+, реакционный буфер. Для постановки ПЦР в смесь
требуется добавить праймеры, матрицу ДНК и воду.
Преимущества использования
Ограничения к использованию

27.

Режим ПЦР следующий:
(1) “горячий старт” 95°С, 5 мин;
(2) денатурация 95°С, 15 с;
(3) отжиг праймеров 64°С, 20 с;
(4) синтез 72°С, 20 с.
Этапы 2–4 повторяют 35 раз.

28.

В качестве референсного гена (housekeeping gene) используют ген фактора элонгации EF1α или GAPDH.
Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или агарозном
геле. Изменение экспрессии гена рассчитывают по методу 2–ΔΔСt. Значения ΔΔСt рассчитывают по формуле
ΔΔСt = ΔСt (контроль) – ΔСt (опыт), каждое значение ΔСt рассчитывают по формуле ΔСt = Сt (ttn) –Сt
(референсный ген). Сt – пороговый цикл.
Разделение линейных молекул
Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:
%
0.3
агарозы
Размер
5-60
DNA
[kbp]
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.2
1.5
2.0
1-30
1-20
0.8-12
0.6-10
0.5-8
0.5-7
0.4-6
0.2-3
0.1-2
Например, расчет результатов ПЦР в реальном времени ведем следующим образом:
Наборы для очистки ДНК из агарозного геля и реакционных смесей
Набор Cleanup Standard
Секвенирование продуктов ПЦР (Евроген, Россия)

29.

Бромистый этидий (3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид,
EtBr, Ethidium bromide

30.

31.

ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских
задач в лабораториях
Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере
биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных
материалах; для детекции ГМО). Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других
патогенов человека и определения их количественного содержания.
Лаборатория «Структуры и функций мышечных белков»
Количественное определение мРНК тайтина, небулина, кальпаинов, кальпастатина, hsp70, hsp90 при
алкогольной миопатии, космическом полёте, моделируемой спонтанной гипертензии