«Тройные» лентивектора. Стабильность и противовирусная активность

1.

«Тройные» лентивектора.
Стабильность и противовирусная
активность.

2.

Схема «Тройных» векторов

3.

1,0E+07
Исходный титр вирусов
1,2E+06
7,2E+05
1,0E+06
3,0E+05
pfu/ml
3,0E+06
SupT1
2,8E+05
2,1E+05
1,0E+05
2,5E+04
N2
1,0E+04
N1
N2
N3
N4
N5
N6
К(GFP)
Viability (MOI=1)
GFP (MOI=1)
100
95
90
85
80
N1
65
55
N2
N3
60
N3
N4
50
N4
N5
40
N5
30
N6
20
GFP
N6
GFP
45
%
%
75
N1
70
N2
10
35
2
5
8
11
14
17
20
dPi
23
26
29
32
35
2
5
8
11
14
17
20
dPi
23
26
29
32
35

4.

1,0E+07
Исходный титр вирусов
1,2E+06
7,2E+05
1,0E+06
3,0E+05
pfu/ml
3,0E+06
SupT1
2,8E+05
2,1E+05
1,0E+05
2,5E+04
1,0E+04
N1
N2
N3
N4
N5
N6
К(GFP)
N5 и N6
GFP (MOI=3)
Жизнеспособноcть (MOI=3)
100
100
90
90
%
80
N1
80
N1
70
70
N3
60
N4
50
N4
50
N5
40
N5
40
N6
30
N6
30
GFP
20
GFP
N3
60
10
20
4
7
10
13
16
19
dPi
22
25
28
31
34
2
5
8
11
14
17
20
dPi
23
26
29
32
35

5.

Противовирусная активность в SupT1(NL4-3)
За два дня до заражения процент трансдуцированных клеток
составлял для N1, N3, N4, GFP - 71, 74, 78, и 95% соответственно

6.

CD4. Задачи.
• Подбор условий трансдукции для CD4.
• Сохранение вектора в CD4: Однократная
активация/еженедельная активация

7.

%GFP
N4, 5dpi
MOI=10,
двукратная трансдукция
66
64
61,75
62
60
58
56
54 52,23
52
50
5 5(II)
64,09
62,36
62,31
58,24
55,77
55,28
10 10(II)
20 20(II)
40
80
MOI
GFP
(однократная активация)
70
N4-5
50
N4-5(II)
40
N4-10
30
N4-10(II)
20
N4-20
10
N4-20(II)
%
60
II – двойная трансдукция с интервалом в 24 часа
Подбор условий трансдукции
Пилотный эксперимент
N4-40
0
5
6
7
8
9
10
11
dPi
12
13
14
15
16
N4-80
∆GFP(16d)=40%

8.

Сохранение вектора: режим активации
%GFP
однократная активация
100
80
GFP
60
N1
N3
40
N4
20
V2O
∆ за 25 дней:
GFP(∆=0%)
mV2o,N1,N4(∆=50%)
N3(∆=30%)
0
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
0
5
8
10
dPi Полиомиелит
%GFP
еженедельная активация
∆ за 25 дней:
100
80
GFP
60
N1
N3
40
N4
20
V2O
0
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
GFP(∆=0%)
mV2o, N1, N3, N4
(∆=25-30%)

9.

Подбор дозы заражения в полиомиелите
X4-тропный
CD4-AD8(1, 10, 100)
1,00E+07
pLAI.2 от 29.12.2017 142нгр/мл.
1,00E+06
Р24 pLAI
1G
1,00E+05
10G
1,00E+04
1,E+07
100G
1,E+06
Пг/мл
14.мар
13.мар
12.мар
11.мар
10.мар
09.мар
08.мар
07.мар
06.мар
1,00E+03
05.мар
Конц. ВИЧ в коп/мл
R5-тропный
1G Ad8 =101,5нгр р24
10G Ad8=1020нгр p24
100G Ad8=10200нгр p24
20 G
1,E+05
20 К
10 G
1,E+04
10 К
СD4-AD8(2, 4)
1,00E+06
?
1,00E+05
2G
1,00E+04
4G
2G Ad8=203нгр p24
4G Ad8=406нгр р24
03.апр
02.апр
01.апр
31.мар
30.мар
29.мар
28.мар
27.мар
1,00E+03
26.мар
Конц. ВИЧ в коп/мл
1,E+03
10 мкл pLAI.2 =1,5нгр р24
20 мкл pLAI.2 =3 нгр p24

10.

Полиомиелит
р24 (1 опыт)
р24(1 опыт)
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+06
пг/мл
N1
1,00E+05
1,00E+05
N1
N3
N3
N4
1,00E+04
N4
1,00E+04
GFP
GFP
V2O
1,00E+03
V2O
1,00E+03
клетки
клетки
1,00E+02
2
3
4
5
6
7
8
1,00E+02
9 10
4
р24 (2 опыт)
7
p24 (2 опыт)
1,00E+06
1,E+06
N1
1,00E+05
N1
1,E+05
пг/мл
N3
N4
1,00E+04
N3
N4
1,E+04
GFP
V2O
1,00E+03
GFP
V2O
1,E+03
клетки
клетки
1,E+02
1,00E+02
2
3
4
5
6
7
8
9
10
4dPi
7dPi

11.

Что можно улучшить
• Оптимизация условий
трансдукции(совместно со стабильностью)
• Режим активации в Полиомиелите

12.

GFP
mV2o
100
88
90
91
95
94
96
93 95
93
96
100
90
83
80
80
%GFP
%GFP
71
66
70
60
50
45
80
5 5 II
10 10
II
70
40
90
90
90
80
80
68
68
%GFP
72
64
64
78
70
60
60
50
50
65
59
58
51
54
64
56
48
5 5 II
10 10
II
20 20
II
40 40
II
68
70
60
64
66
65
60
58
57
10 10
II
20 20
II
40 40
II
55
50
40
40
%GFP
100
75
40 40
II
N4
100
73
20 20
II
N3
100
70
79
77
50
41
N1
%GFP
79
89
86
60
40
80
86
85
40
5 5 II
10 10
II
20 20
II
40 40
II
5 5 II
Двойная трансдукция эффективнее однократной в среднем на 10%.
II – двойная трансдукция с интервалом в 24 часа
Подбор условий трансдукции
для всех векторов (5dPi)

13.

Динамика сохранения вектора
0,625
1,25
2,5
5
10
20
40
0.625 II
1.25 II
2.5 II
5 II
10 II
20 II
40 II
100
90
%GFP
80
70
60
∆≈0%
50
40
30
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
mV2o(LD)
100
∆≈15%
10
80
20
70
40
60
5 II
50
10 II
40
20 II
30
40 II
5
dpi
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
dpi
N1 (LD)
N3 (LD)
N4 (LD)
80
80
80
5
70
70
70
10
∆≈40%
∆≈20%
60
∆≈27%
60
%GFP
60
%GFP
5
90
%mCherry
GFP (LD)
20
40
50
50
40
40
40
10 II
30
30
30
20 II
20
20
20
40 II
5
7
9
11
13
dpi
15
17
19
5
7
9
11
13
dpi
15
17
19
50
5 II
5
7
9
11
13
dpi
15
17
19

14.

Выводы:
1. В SupT1 вектор N1 был стабильным, в CD4 самый не стабильный.
GFP (MOI=3)
100
∆ c 8dpi по 20dpi
95
SupT1
90
N1
85
N3
N4
80
GFP
75
GFP~1%
N1~1%
N3~4%
N4~3%
70
2
5
8
11
14
17
20
23
26
29
32
35
GFP 10 II (LD)
∆ c 9dpi по 19dpi
100
90
CD4
80
GFP
70
N1
60
N3
50
N4
40
mV2o
GFP~0%
N1~17%
N3~4%
N4~10%
mV2~0%
30
5
7
9
11
13
15
17
19
2. Процент CD4 клеток содержащих тройные вектора падает при
культивировании. На сегодняшний день лучше всех показал себя V2o.

15.

Выводы:
3.
«Рейтинг»
тройных
согласно
противовирусной активности в SupT1 и CD4
отличался(N1).
CD4
р24 (1 опыт)
1,00E+07
1,00E+06
пг/мл
SupT1
N1
1,00E+05
N3
1,00E+04
N4
GFP
1,00E+03
клетки
1,00E+02
2
3
4
5
6
7
8
9 10
CD4
р24 (2 опыт)
N1
1,00E+06
4. Проблема с повторяемостью опытов по
оценке противовирусной активности на CD4.
5.Проблема с заражением ССR5-тропным
HIV.
пг/мл
1,00E+05
N1
N3
1,00E+04
N4
GFP
1,00E+03
клетки
1,00E+02
2
3
4
5
6
7
8
9
10

16.

ПЛАНЫ
• Оптимизация протокола ведения
зараженных клеток в Полиомиелите.
• Оценка влияния отдельных генов на
стабильность.