Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

1. Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов анализа и оптических сенсорных систем
Использование хлорофилла как флуорофора для
визуализации и определения гидрофильных
соединений
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023

2. Использование хлорофилла

Хлорофилл – зелёный пигмент растений,
длинноволновый флуорофор (λem=680 нм)
Применение
Литература
Определение низкомолекулярных
соединений
1. Отдельные работы (в основном, химически
модифицированный хлорофилл)
2. Определение неомицина*
Визуализация доставки
лекарственных веществ
Нет работ**
* Zakharenkova S.A. e.a. ACS Sustain. Chem. Eng. 2021, 9, 3408.
**Визуализация доставки изучена С.А. Захаренковой с использованием
карбоцианиновых флуорофоров: Zakharenkova S.A. e.a. Molecules, 2021, 26, 7426.
2

3. Цель работы:

Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина, метотрексата и
бензилпенициллина в воде и искуственной моче в виде тройных
агрегатов аналит-краситель-противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использований хитозанов и плюроников.
3
3

4. Структуры лекарственных веществ

цефтриаксон
бензилпенициллин
метотрексат
блеомицин
винорелбин
4

5. Методика. Схема визуализатора

Схема устройства регистрации флуоресценции в БИК-диапазоне:
1 – фотокамера, оснащенная светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны более 700 нм,
2 – одиннадцать последовательно закрепленных красных светодиодов с максимумом излучения 660 нм,
3 – алюминиевый радиатор для охлаждения светодиодов,
4 – 96-луночный планшет с образцами,
5 – светонепроницаемый кожух
5

6. Выделение хлорофилла из шпината

• Экстракция смесью ацетона и гексана (1:1 об.)
• Удаление экстрагента испарением
• Растворение полученного остатка в ацетоне
• Разделение смеси на фракции методом ТСХ
• Десорбция ацетоном
5

7. Спектры выделенных фракций

Интенсивность
поглощения, усл. ед.
Спектры поглощения
Спектры флуоресценции
Хлорофилл a
Хлорофилл b
Феофитины
Хлорофилл a
Хлорофилл b
Феофитины
Длина волны поглощения, нм
Выделенные фракции распознавали,
сравнивая их спектры с литературными
данными.
Хлорофилл а флуоресцирует, а хлорофилл b – нет.
Далее использовали хлорофилл а.
7

8. Структуры ПАВ

Цетилтриметиламмония бромид (ЦТАБ)
Полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ)
Додецилсульфат натрия (ДДС)
Лаурат натрия
Для определения лекарственных веществ:
Требовалось найти системы хлорофилл-ПАВ-аналит
с наибольшей разностью сигналов тройного агрегата и контрольного опыта
8

9. Выбор условий определения цефтриаксона

Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
100
хлорофилл-ПАВцефтриаксон
0
а)
в)
хлорофилл-ПАВ
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
V ПГМГ, мкл
80
40
20
0
б)
хлорофиллЦТАБ
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
хлорофиллПАВцефтриаксон
60
0
200
100
200
V цефтриаксона, мкл
120
Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
Зависимость флуоресценции тройного агрегата с цефтриаксоном
от концентраций компонентов
хлорофиллЦТАБцефтриаксон
хлорофиллПГМГ-ЦТАБцефтриаксон
100
80
60
хлорофиллПГМГ-ЦТАБ
40
20
0
0
10
V ЦТАБ, мкл
20
г)
0
100
время, мин
а) ПГМГ', б) цефтриаксона, в) ЦТАБ, г) времени.
200
9
Условия определения
цефтриаксона и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• раствор хлорофилла 30-40
мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 60 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• анализируемый раствор 100
мкл.

10. Выбор условий определения бензилпенициллина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с бензилпенициллина от концентраций компонентов
без бензилпенициллина
100
с бензилпенициллином
Интенсивность
флуоресценции
120
80
60
40
Условия определения
бензилпенициллина и получения
тройных агрегатов для контейнеров:
• раствор хлорофилла 10-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• анализируемый раствор 100 мкл.
20
0
ЦТАБ,
а)
ПГМГ,
ЦТАБ
ПГМГ
70
Интенсивность
флуоресценции
60
50
40
30
20
10
0
б)
0
100
200
V бензилпенициллина, мкл
300
а) природы ПАВ, б) бензилпенициллина.
10

11. Выбор условий определения винорелбина

50
40
30
20
10
0
0
20
40
V ПГМГ, мкл
60
б)
0
10
20
V ЦТАБ, мкл
Флуоресценция в течение часа
70
Интенсивность
флуоресценции
а)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
Зависимость флуоресценции тройного агрегата с винорелбином от концентраций компонентов
в)
60
50
40
30
0
10
20
V винорелбина, мкл
30
30
Условия определения
винорелбина и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• раствор хлорофилла 15
мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• анализируемый раствор 10
мкл.
а) ПГМГ, б) ЦТАБ, в) винорелбина и времени: измеряли флуоресценцию каждой системы каждые 5
мин; Стандартные отклонения означают колебания флуоресценции в течение 1 ч.
11

12. Возможность образования тройных агрегатов с одноимённо заряженными ПАВ

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с винорелбином от природы ПАВ
ЦТАБ+ДДС
ПГМГ+ДДС
ПГМГ+ЦТАБ
ПГМГ
с вин.
ЦТАБ
без вин.
ДДС
нет ПАВ
0
20
40
60
80
100
Интенсивность флуоресценции
• Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как с катионными, так и с
анионным ПАВ (ЦТАБ и ДДС).
• Добавление ПГМГ в качестве коиона повышает разность сигнала и контрольного опыта.
12

13. Выбор условий определения блеомицина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с цефтриаксоном от концентраций компонентов
50
50
40
30
20
10
0
5
рН
10
15
30
20
10
б)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
50
100
V ПГМГ, мкл
150
0
20
40
V блеомицина, мкл
60
100
Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
40
0
0
а)
в)
Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
60
0
10
V ДДС, мкл
20
80
60
Условия определения
блеомицина и получения
тройных агрегатов для контейнеров:
• раствор хлорофилла 10 мкл;
• буфер бура (рН=8,5/9,2) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 20 мкл;
• ДДС (0,008 м) 10 мкл;
• анализируемый раствор 10 мкл.
40
20
0
г)
а) рН, б) ПГМГ, в) ДДС, г) блеомицина.
13

14. Зависимость сигналов от времени

Агрегаты хлорофилл-ПГМГ-ДДС-блеомицин и контрольный опыт
Интенсивность флуоресценции
90
80
70
60
контроль с ПГМГ и
ДДС
50
тройной агрегат с
блеомицином
40
30
0
10
20
Время, мин
30
40
• Сразу после приготовления сигналы различаются почти вдвое, однако через 7-10 минут
различие исчезает.
• Измерять флуоресценцию систем, где присутствует подобное сочетание необходимо сразу
после приготовления (системы с блеомицином и винорелбином).
14

15. Эффект коиона в системе хлорофилл-ПГМГ-ДДС-блеомицин

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с блеомицином от концентрации ПГМГ
50
45
Интенсивность
флуоресценции
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
50
V ПГМГ, мкл
100
150
• Без ПГМГ тройные агрегаты хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольного
опыта (без блеомицина).
• ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину: флуоресценция возрастает в
диапазоне концентраций ПГМГ (0,0056 М) от 0 до 20 мкл.
• Эффект коиона наблюдается только с блеомицином и винорелбином.
15

16. Выбор условий определения метотрексата

без ПАВ
с метотрексатом
ПГМГ
без метотрексата
Интенсивность
флуоресценции
Зависимость флуоресценции тройного агрегата с метотрексатом от концентраций компонентов
ДДС+ПГМГ
ЦТАБ+ПГМГ
ДДС
ЦТАБ
0
20
40
60
Интенсивность флуоресценции
б)
50
100
V ПГМГ, мкл
150
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
60
40
20
0
0
в)
0
Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
а)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10
20
V ЦТАБ, мкл
30
г)
0
50
100
V метотрексата, мкл
а) природы ПАВ, б) ПГМГ, в) ЦТАБ, г) метотрексата.
150
Условия определения
метотрексата и получения
тройных агрегатов для
контейнеров:
• раствор хлорофилла 15-20
мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 20-40 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• анализируемый раствор
100 мкл.
16

17. Определение лекарственных веществ в водном растворе

90
65
80
60
70
60
50
40
30
0,0E+00
а)
Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций аналита:
а) блеомицина, б) винорелбина, в) метотрексата, г) бензилпенициллина.
y = 180000x + 44,417
R² = 0,921
5,0E-05 1,0E-04 1,5E-04
С блеомицина, М
2,0E-04
в)
Интенсивность
флуоресценции
Интенсивность
флуоресценции
90
70
60
50
40
30
0,0E+00
y = 78800x + 42,967
R² = 0,9413
2,0E-04
4,0E-04
С метотрексата, М
6,0E-04
г)
17
50
45
y = 31038x + 35,7
R² = 0,9933
40
35
30
0,0E+00
б)
80
55
65
60
55
50
45
40
35
30
0,0E+00
2,0E-04 4,0E-04 6,0E-04
С винорелбина, М
8,0E-04
y = 87000x + 36,6
R² = 0,9688
1,0E-04
2,0E-04
С бензилпенициллина, М
3,0E-04

18. Определение метотрексата и бензилпенициллина в моче

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций
аналита: а) метотрексата, б) бензилпенициллина.
85
80
75
70
65
60
55
50
y = 8231,7x + 54,201
R² = 0,847
45
40
0,0E+00
а)
90
Интенсивность флуоресценции
Интенсивность флуоресценции
90
5,0E-04
1,0E-03
1,5E-03
2,0E-03
C метотрексата в моче, М
2,5E-03
80
70
60
50
30
0,0E+00
3,0E-03
y = 21105x + 55,481
R² = 0,8045
40
5,0E-04
1,0E-03
С бензилпенициллина, М
б)
18
1,5E-03

19. - Показана возможность использования тройных агрегатов для определения - цефтриаксона, блеомицина, метотрексата, винорелбина,

Характеристики методик определения лекарственных веществ
в воде и искусственной моче
предел
обнаружения,
М
В воде
общее
число
точек
Блеомицин
1,1·10-4
12
(1,1-1,7) ·10-4
-
-
-
Винорелбин
3,4·10-4
20
(3,4-6,5) ·10-4
-
-
-
Метотрексат
1,4·10-4
12
(1,4-5,0) ·10-4
7,6·10-4
14
(7,6-2,7) ·10-4
4,5·10-5
15
(4,5-2,7) ·10-5
1,0·10-3
22
-
Аналит
Бензилпенициллин
линейный
диапазон, М
В искусственной моче
предел
общее
линейный
обнаружения,
число
диапазон, М
М
точек
Показана возможность использования тройных агрегатов для определения
- цефтриаксона, блеомицина, метотрексата, винорелбина, бензилпенициллина –
в водном растворе на уровне 0,1 мМ,
- метотрексата и бензилпенициллина – в искусственной моче на уровне 1 мМ.
19

20.

Контейнеры для визуализации доставки
лекарственных веществ
(полимер – лекарственное вещество – ПАВ – хлорофилл)
Структуры полимеров
немодифицированный хитозан
карбоксиметилированный хитозан
плюроник F-68
плюроник F-127
20

21. Контейнеры с цефтриаксоном и метотрексатом для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции от природы полимера контейнеров с а) цефтриаксоном б) метотрексатом
полиакриловая кислота
полиакрил. к-та
полистир. со-мал.
кислота, соль
полистир. со-мал. к-та, соль
альгинат
альгинат
плюроник F-127
плюроник F-127
плюроник F-68
с цефтриаксоном
плюроник F-68
карб. хз
мал. сульф. хит.
мал. несульф. хит.
без цефтриаксона
немод. хит.
немод. хз
а)
без мет.
карб. хит.
мал. несульф. хз
0
50
100
Интенсивность флуоресценции
с мет.
без полимера
б)
0
50
100
Интенсивность флуоресценции
• Для контейнеров с цефтриаксоном в качестве полимеров выбраны немодифицированный,
карбоксиметилированный и малеинированный хитозаны.
• Для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127.
• Частицы: размер 10-1000 нм, дзета-потенциалы около 0 мВ.
21

22. Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином а) от природы полимера
б) природы полимера и осаждения
мал. хз
полиакрил. к-та
полистир. к-та
альгинат
плюроник F-68
карб. хз
плюроник F-127
с вин.
мал. хит.
без вин.
плюроник
F-68
карб. хит.
немод. хит.
без полимера
0
а)
20
40
60
б)
Интенсивность флуоресценции
с вин.
без вин.
с вин.
без вин.
с вин.
без вин.
осадки после выд-ния
растворы после
выделенияния
до выделения
0
20
40
60
80
Интенсивность флуоресценции
• Для получения контейнеров с винорелбином изучены плюроники F-68 и F-127,
несульфатированный и сульфатированный малениированные хитозаны.
• Только контейнеры с карбоксиметилированным хитозаном сохраняют
флуоресценцию после выделения осаждением.
• Другие полимеры дают осадок, флуоресцирующий на уровне контрольного опыта.
22

23. Выбранные полимеры для получения контейнеров

Аналит
Полимер
Немодифицированный хитозан
Цефтриаксон
Карбоксиметилированный хитозан
Малениированный хитозан
Метотрексат
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Винорелбин
Малениированный хитозан несульф.
Малениированный хитозан сульф.
23

24. Ковалентная сшивка контейнеров с винорелбином эпихлоргидрином

Зависимость флуоресценции контейнеров
с винорелбином от природы хитозана
Интенсивность флуоресценции
30
25
20
без вин.
15
10
с вин.
5
0
карб. хит.
мал. хит.
• В сшитых контейнерах с винорелбином и хитозанами нет
разности с контрольным опытом
• Переход к работе с несшитыми контейнерами
24

25. Стабильность флуоресценции тройных агрегатов и контейнеров с цефтриаксоном

Зависимость флуоресценции контейнеров от природы хитозана и времени
Интенсивность флуоресценции
120
Несшитые без цефтриаксона
Несшитые с цефтриаксоном
Сшитые без цефтриаксона
Сшитые с цефтриаксоном
100
80
60
40
20
0
без хит. немод. карб.
хит.
хит.
мал.
хит.
Сразу после приготовления
без хит. немод. карб.
хит.
хит.
мал.
хит.
Через 2 дня после
приготовления
Изменение сигнала (относительно контроля) во временем (в течение двух суток):
- тройные агрегаты (без полимера): уменьшается
- несшитые контейнеры с немод. хитозаном: сохраняется
- сшитые контейнеры с немод. хитозаном: возрастает (выталкивание цефтриаксона сшивателем из
агрегатов)
25

26. Сохранение флуоресценции в тройных агрегатах с винорелбином

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином от природы ПАВ и времени
ПГМГ+лаурат в воде через день
ПГМГ+лаурат в воде сразу
ПГМГ+лаурат в ацетоне через день
с вин.
ПГМГ+лаурат в ацетоне сразу
без вин.
ПГМГ+ДДС через 2 дня
ПГМГ+ДДС сразу
0
20
40
60
80
100
Интенсивность флуоресценции
• Флуоресценция сохраняется в течение двух суток, если в качестве ПАВ использованы ПГМГ+ДДС или
лаурат в ацетоне
• В случае лаурата в воде разность с контрольным опытом появляется через сутки
• Принято решение далее работать с лауратом в воде (наименее токсичен)
26

27. Сохранение флуоресценции в несшитых контейнерах с винорелбином

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином от природы ПАВ, природы хитозана и времени
через сутки
плюроник F-68+лаурат в…
мал. сульф. хз меч.+лаурат в…
карб. хз меч.+лаурат в ацетоне
лаурат в ацетоне
с винорелбином
ацетон вместо лаурата
без винорелбина
сразу после
приготовления
плюроник F-68+лаурат в…
мал. сульф. хз меч.+лаурат в…
карб. хз меч.+лаурат в ацетоне
лаурат в ацетоне
ацетон вместо лаурата
0
20
40
60
80
Интенсивность флуоресценции
• Возможна замена токсичного ДДС на лаурат в ацетоне (в случае тройного агрегата с винорелбином и
контейнеров с винорелбином и карбоксиметилированным, малеинированным сульфатированным
хитозанами, плюроником F-68); Принято решение далее работать с ними
• В системах с лауратом флуореценция через сутки возрастает
27

28. Устойчивость к диализу несшитых контейнеров

Состав контейнера
Аналит
полимер
ПАВ
Время диализа до разрушения
контейнера
Плюроник F-68
Лаурат
1ч
Плюроник F-127
Лаурат
1ч
Карб. хит.
ЦТАБ-ПГМГ
45 мин
Плюроник F-68
ЦТАБ-ПГМГ
10 мин
Плюроник F-127
ЦТАБ-ПГМГ
10 мин
Винорелбин
Метотрексат
Контейнеры с винорелбином и плюрониками устойчивы к диализу в течение 1 ч,
Контейнеры с метотрексатом и карбоксиметилированным хитозаном устойчивы к диализу по
крайней мере в течение 45 мин
Разрушение контейнеров с метотрексатом и плюрониками начинается в течение 10 мин
Все изученные системы потенциально пригодны для доставки в клетки
28

29. Методика работы с клетками аденокарциномы молочной железы человека

Живые клетки сорбированы на дне лунок при 37˚С:
1) Промывка ячеек фосфатным буферно-солевым
раствором (PBS)
Ячейки для конфокального микроскопа
2) Заливание коллоидного раствора контейнеров
3) Инкубирование при 37˚С в течение 40 минут
4) Отбор раствора и промывка PBS
5) Фиксация (4%-формальдегид и выдерживание
без термостата 15 минут)
Работа с фиксированными клетками:
6) Промывка PBS
7) Заливка смеси глицерин – PBS (1:1 об.)
Фиксированные клетки могут храниться несколько
дней.
Далее исследование на конфокальном микроскопе.
29

30. Результаты поглощения контейнеров клетками

30

31. Результаты эндоцитоза

1) Есть поглощение контейнеров клетками
2) Флуоресценция наиболее заметна в цитоплазме, на ядерной мембране и в ядрышках ядра клеток
после интернализации контейнеров. Доставка в ядро интересна для визуализации доставки
противораковых веществ
3) Сигнал контейнеров тройного агрегата выше, чем сигнал в отсутствие аналита, это означает, что
переносится именно контейнер с тройным агрегатом.
Флуоресценция клеток после поглощения контейнеров
Винорелбин (лаурат, без полимера)
Метотрексат (ПГМГ, ЦТАБ, плюроник
F-127)
Цефтриаксон (ПГМГ, ЦТАБ, карб.
хитоз.)
0
40
80
120
160
Интенсивность флуоресценции клеток
Контейнеры с лекарственным веществом
«Пустые» контейнеры (контроль)
31

32. Выводы

1. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и противоионом и показана
возможность их использования для определения цефтриаксона, блеомицина, метотрексата,
винорелбина, бензилпенициллина в водном растворе на уровне 0,1 мМ, а метотрексата и
бензилпенициллина – в искусственной моче на уровне 1 мМ.
2. Выявлено образование флуоресцирующего агрегата блеомицина с одноименно заряженным полимером
(блеомицин(2+) – полигексаметиленгуанидин(+) (ПГМГ) – додецилсульфат(–) – хлорофилл). В отсутствие
ПГМГ («коиона») флуоресценция агрегатов не отличается от флуоресценции контрольного опыта (без
блеомицина). Для ранее изученных модельных аналитов эффект «коиона» не наблюдали.
3. Взаимодействием тройных агрегатов (хлорофилла с модельными лекарственными веществами и
противоионами) с анионированными хитозанами или плюрониками получены контейнеры для
визуализации доставки цефтриаксона, метотрексата и винорелбина в эукариотические клетки.
4. Ковалентная сшивка контейнеров эпихлоргидрином не позволила получить устойчивого сигнала
модельных лекарственных веществ. Показана возможность длительного сохранения флуоресценции
выше сигнала контрольного опыта в тройных агрегатах без полиэлектролита и несшитых контейнерах
на основе карбоксиметилированного и малеинированного хитозана и плюроников F-68 и 128.
5. Показано сохранение флуоресценции контейнеров винорелбин – лаурат – плюроник F-68 (или F-128) во
время диализа против фосфатно-солевого буфера по крайней мере в течение 1 часа (в отличие от
аналогичных контейнеров с метотрексатом, ПГМГ и ЦТАБом, разрушающихся за 10 мин).
6. Показано проникнование контейнеров с винорелбином, цефтриаксоном и метотрексатом в клетки
аденокарциномы молочной железы человека с сохранением флуоресценции выше контрольного опыта.
Наблюдали распределение флуоресцирующих частиц в структуры цитоплазмы, ядерную мембрану и
ядрышко ядра.
32

33. Спасибо за внимание!

33