Принципы технологии рекомбинантной ДНК

1.

Принципы технологии рекомбинантной ДНК
Выполнил:
Мухамадиева Н.И.

2.

Рекомбинантная ДНК — молекула ДНК, полученная в результате
объединения in vitro чужеродных (в природе никогда вместе не
существующих) фрагментов ДНК с использованием методов генной
инженерии.
Технология рекомбинантных ДНК (также молекулярное
клонирование, или генная инженерия) — это совокупность
экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос
генетического материала (ДНК) из одного организма в другой.
2

3.

Схема клонирования рекомбинантной ДНК
3

4.

Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) – большая группа
бактериальных ферментов (нуклеаз), катализирующих разрыв
двухцепочечных ДНК после распознавания ими специфической
нуклеотидной последовательности.
3 основных типа рестриктаз:
•Ⅰтип – разрезают ДНК в произвольной точке;
•Ⅱтип – разрезают ДНК в определенной точке внутри участка
распознавания;
•Ⅲтип – разрезают ДНК, отступив определенное число нуклеотидных
пар от участка распознавания.
Два варианта гидролиза нуклеотидной
последовательности:
1)Косое расщепление двойной спирали ДНК с
образованием «липких концов»;
2)Перпендикулярный разрыв с образованием
«тупых концов».
4

5.

ДНК-лигазы, используя энергию АТФ, катализируют образование фосфодиэфирных
связей между концами спаренных полинуклеотидных цепей либо между «тупыми»
концами отдельных фрагментов рестрикции.
ДНК-лигазы бывают двух видов:
1)Лигаза интактных клеток E. coli – катализирует соединение «липких» концов;
2)Лигаза, индуцированная в E. coli при заражении фагом T4 – катализирует соединение
«тупых» концов.
5

6.

Рестриктазно-лигазный метод
построения гибридных ДНК
Коннекторный метод построения
рекомбинантных ДНК
6

7.

Применение векторов в генетической инженерии
Векторная молекула – молекула ДНК, обеспечивающая перенос и стабильное
существование чужеродного фрагмента ДНК в клетке-хозяине.
Требования к векторным молекулам:
1)вектор должен быть мелкой молекулой ДНК;
2)внесение вектора в клетку не должно быть технически сложным;
3)метод производства и очистки вектора должен быть простым;
4)вектор должен иметь ограниченное количество сайтов рестрикции (в идеале –
только один для каждой рестриктазы);
5)он должен содержать генетический маркер, который впоследствии поможет в
отборе клонов, несущих гибридные ДНК;
6)вектор не должен терять репликативные функции при встраивании чужеродного
фрагмента ДНК.
7

8.

По происхождению векторы бывают:
•Плазмидные
•Фаговые
•Гибридные (сочетают свойства плазмид и фагов)
В настоящее время все существующие клонирующие векторы можно
классифицировать на три основных разновидности:
•амплифицирующие – обеспечивают размножение (амплификацию) полученной
рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине;
• экспрессирующие – наряду с размножением обеспечивают правильную и
эффективную экспрессию чужеродных генов в клетках-хозяина, т.е. результатом
работы таких векторов является синтез требуемого белка. Совершенствование
экспрессирующих векторов позволяет создавать штаммы – суперпродуценты
необходимых белков;
•интегративные – при определенных условиях могут встраиваться в геном
бактериальной клетки или вирусный геном.

9.

Плазмидный вектор
Плазмиды – это внехромосомные, автономно
реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые
молекулы ДНК. Плазмиды встречаютсяпрактически у
всех бактерий. Размеры плазмид варьируют от 1 т.п.н. до
500 т.п.н.
Плазмиды бывают:
•Высококопийные (до 100 копий в клетке)
•Низкокопийные (1-4 копий).
С помощью плазмидных векторов можно
клонировать фрагменты ДНК размеров до 10 кб.
Для целей генетической инженерии требуются плазмиды, обладающие
тремя важными свойствами:
Небольшой размер (менее 15 т.п.н.), необходимый для эффективного
переноса;
Наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть
осуществлена вставка;
Наличие одного или более селективных генетических маркеров для
идентификации рецепиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.
9

10.

Вектор на основе фага λ
ДНК фага λ – это линейная
двухцепочечная молекула размером около
48502 п.о. с одноцепочечными 5’- концами из
12 нуклеотидов. Их называют cos-концами
(cos-сайтами), они взаимокомплементарны и
могут спариваться друг с другом с
образованием кольцевой молекулы. В зрелых
вирионах ДНК находится в форме линейной
молекулы, попадая в клетку, ДНК
циклизуется по соs-сайтам и функционирует в
кольцевой форме.
Можно клонировать до 20 кб чужеродной
ДНК.
10

11.

Трансформация бактериальных клеток
Трансформация – введение рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина.
Компетентность – физиологическое состояние клетки, в котором она способна
поглощать нуклеиновую кислоту из окружающей среды.
Методы трансформации E. coli
1.Метод замораживания-оттаивания. Непродолжительное замораживание клеток
совместно с плазмидой при -70⁰ С и последующее оттаивание при 37 ⁰ С .
Поглощение ДНК происходит очень быстро в присутствии CaCl2.
2.Метод электропорации – создание пор в бислойной липидной мембране под
действием электрического поля.
11

12.

Отбор гибридных клонов бактериальных клеток
12