Определение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в крови и их агрегаты с тромбоцитами

1.

Практика по получению первичных
профессиональных умений и навыков
Научный руководитель
Свешникова А. Н.
"Лабораторно-диагностические
исследования"
Определение циркулирующих
опухолевых клеток (ЦОК) в крови
и их агрегаты с тромбоцитами.
Студент 5 курса специальности «Медицинская биофизика» 715-01
Ерохина Яна Романовна
Лаборатория
внутриклеточной
сигнализации и системной
биологии

2.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии
https://cyberleninka.ru/article/n/tsirkuliruyuschie-opuholevye-kletki-biologiya-metody-vydeleniyaklinicheskoe-znachenie-pri-rake-molochnoy-zhelezy Циркулирующие опухолевые клетки: биология,
методы выделения, клиническое значение при раке молочной железы Ю.Н.Ненахова,
В.К.Лядов,И.В.Поддубная
ЦОК- основной механизм метастазирования рака.
Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК), представляют
собой раковые клетки, которые отделяются от первичной
опухоли и попадают в кровоток. Они могут
распространяться по всему организму и образовывать
вторичные опухоли (метастазы).
Взаимодействие между ЦОК и тромбоцитами может
влиять на их способность к метастазированию и
выживанию в кровотоке. Фибриноген — это белок плазмы
крови, который участвует в свёртывании крови и
формировании тромбов. Он также может
взаимодействовать с ЦОК и влиять на их поведение.
Изучение этих взаимодействий может помочь понять, как
ЦОК распространяются по организму, и разработать
стратегии для предотвращения метастазов и улучшения
лечения рака.
https://www.nature.com/articles/s41568-022-00536-4/figures/1

3.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии
Актуальность работы:
1) Риск тромбоза
Более 90% онкобольных пациентов имеют изменение в свёртываемости
крови. Симптомы тромбоза прямо соотносятся с прогрессом развития
опухоли и метастазированием.
От 20% до 30% онкобольных умирают от тромбоза.
2) Защита от иммунной системы
Тромбоциты играют важную роль в эпителиально-мезенхимальной
переходе раковых клеток и их интравазации путем создания
микроокружения для раковых клеток, защищая их от элиминации
иммунной системой и позволяя циркулирующим опухолевым клеткам
выжить в кровотоке.

4.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии
Цель работы в рамках лабораторной практики:
Создать биологическую модель агрегатов ЦОК с использованием донорской крови и
опухолевых клеток MCF-7 (рак молочной железы), а также выявить их с помощью
метода конфокальной микроскопии.
Ход работы:
1. Фильтрация смеси кровь+опухоль
2. Простая покраска азур-эозином
3. Сложная покраска флуоресцентными метками
4. Исследование образцов на световом микроскопе
5. Исследование образцов при помощи конфокальной микроскопии
6. Анализ результатов

5.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии
Протокол фильтрации.
1. В 9 мл донорской цитратной крови добавляют 175 мкл раковых
клеток MCF-7.
2. Для пробы с кальцием к 4,5 мл полученной смеси добавляют 4,5 мкл
гирудина и 20 мкл 5 М Ca2+.
3. Примерно 30 мл 1% BSA буфера набирают в шприц и присоединяют
к установке через трубку. Надавливая на поршень, наполняют
установку буфером так, чтобы была покрыта верхняя мембрана.
4. Шприц фиксируют в аппарате насоса. Насос оттягивает поршень
шприца со скоростью 0,5 мл/мин.
5. Кровь из пробирки наливают в камеру верхней кассеты и запускают
насос. После перекачивания всей крови мембраны извлекают,
помещают на фильтровальную бумагу, наносят на каждую мембрану
по 50 мкл фетальной телячьей сыворотки, затем мембраны
помещают на стекло и крутят в центрифуге пару секунд.
Нижний фильтр окрашивают по Романовскому и исследуют под
световым микроскопом.
Верхний фильтр фиксируют, окрашивают первичными и вторичными
антителами, флуоресцентными метками и исследуют с помощью
конфокального микроскопа.
.
Кассета верхняя
(1) и нижняя (2)
Между ними три
силиконовые
прокладки (3),
между которыми
две мембраныфильтра (4)

6.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии
Простая покраска азур-эозином
Фиксатор по Май-Грюнвальду: неразбавленным красителем покрыть стёкла на 3 минуты, затем смыть дистиллятом и высушить
Покраска азур-эозином: разбавленный краситель в буферном растворе (1:9) нанести на стёкла и оставить в течении 15-20 минут.
Промыть в буферном растворе, оставить до полного высыхания.
Далее эти стёкла можно смотреть под световым микроскопом.

7.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии
Сложная покраска первичными, вторичными антителами и
флуоресцентными метками. Протокол покраски с расчётом на 2 стекла.
1. Нанести по одной капле фосфатно-солевого буфера (PBS) на предметные стёкла и подождать 5 минут (этап промывки).
2. На каждое стекло нанести по 200 мкл фиксатора параформальдегида (PFA) и оставить на 20 минут (этап фиксации).
3. Промыть образцы в PBS в течение 5 минут один раз.
4. На каждое стекло добавить по 250 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы закрыть свободные альдегидные группы
для дальнейшей окраски, и оставить на один час.
5. Промыть образцы в PBS в течение 5 минут один раз.
6. Смешать 600 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) с 6 мкл антитела Ab-326 и добавить по 300 мкл смеси на каждое
стекло. Инкубировать в течение одного часа.
7. Промыть образцы в PBS в течение 5 минут два раза.
8. Смешать 600 мкл 1% BSA с 1,5 мкл флуоресцентного красителя Alexa-555 и добавить по 300 мкл на каждое стекло. Оставить на
один час для инкубации.
9. Промыть образцы в PBS в течение 5 минут один раз.
10. Смешать 600 мкл 1% BSA с 1 мкл красителя Хекст (ядра), 3 мкл CD-41 (тромбоциты) и 6 мкл вторичного антитела ABtoFb-FITC
(фибриноген) и добавить по 300 мкл на каждое стекло. Инкубировать один час.
11. Промыть образцы в PBS в течение 5 минут три раза.

8.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии

9.

10.

11.

12.

13.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии
Анализ результатов:
С помощью конфокальной микроскопии было проведено сравнение фильтров с кальцием и без него.
В пробах без кальция на одно стекло приходилось порядка 6–8 одиночных опухолевых клеток с небольшими
агрегатами или вовсе без них.
В то время как в пробах с кальцием наблюдалось большое количество крупных агрегатов ЦОК с тромбоцитами и
фибриногеном.
При помощи световой микроскопии были сравнены четыре группы фильтров:
1. кровь с опухолями без кальция;
2. кровь с опухолями с кальцием;
3. кровь без опухолей без кальция; (отрицательная проба)
4. кровь без опухолей с кальцием. (отрицательная проба)
В третьей и четвёртой группах визуально не было обнаружено специфических агрегатов.
В первой группе было обнаружено небольшое количество (порядка 6–8 опухолевых клеток на стекло) ЦОК с
небольшими агрегатами или же вовсе без них.
Во второй группе были обнаружены большие количества крупных агрегатов.

14.

Определение циркулирующих
опухолевых клеток в крови (ЦОК) и
их агрегаты с тромбоцитами
Лаборатория внутриклеточной
сигнализации и системной биологии
Заключение
В ходе прохождения лабораторной практики были изучены и освоены различные методы лабораторных
исследований, такие как фильтрация, простая и сложная окраска, конфокальная и световая микроскопия.
Эксперимент позволил получить и обнаружить агрегаты циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) с
тромбоцитами и фибриногеном, что может послужить основой для дальнейших экспериментов и исследований в
области изучения ЦОК.
Перспективы исследования
Для получения более точных данных планируется использовать кровь пациентов и добавлять в смесь другие
субстраты. Это позволит более глубоко изучить механизмы взаимодействия между ЦОК, тромбоцитами и другими
компонентами крови. Также предполагается дальнейшее изучение связи между фибриногеном и ЦОК и
возможное применение чипирования для более точного анализа и мониторинга состояния пациентов.

English Русский Правила