Презентация_1 год_SA_Red

1.

Попичева Е.А.
Дизайн, синтез и свойства индукторов
ангиогенеза на основе плазмидной ДНК
ОТЧЁТ
аспиранта дневной формы обучения
по итогам первого учебного года
по специальности «Биоорганическая химия»
Научный руководитель: Янцевич Алексей Викторович, канд. хим. наук
E-mail: [email protected]

2.

Цель исследования: разработка генотерапевтических
средств на основе кольцевых ДНК со вставками генов VEGF,
Ang-1 и оценка их ангиогенной активности в экспериментах
in vitro и in vivo.
Задачи исследования:
1. получение синтетических генов гибридных белков
Ang-1_VEGF165 и VEGF_Ang-1;
2. создание экспрессионного вектора, содержащего CMVпромотор-энхансер, необходимого для наработки
гибридных белков в клетках человека;
3. получение плазмидной ДНК в препаративных
количествах (100 мг);
4. Дизайн экспрессионных векторов и праймеров для
клонирования генов гибридных белков Ang-1_VEGF165
и VEGF165_Ang-1 в экспрессионные вектора для
наработки в бактериальных клетках.
2

3.

Актуальность
Хроническая ишемия нижних конечностей
является одной из самых распространенных и
актуальных патологий сердечно-сосудистой
системы человека.
3

4.

5.

Методы исследования
Биоинформационный анализ
Модели гибридных белков c присоединением VEGF165
(а, синий) по С концу ANGPT1 (зеленый) и с
присоединением (б) VEGF165 по N концу Ang-1
5

6.

Получение синтетического гена Ang-1_VEGF165 от ампликонов
отдельных генов до гена гибридного белка Ang-1_VEGF165 с линкерами
перед лигированием в экспрессионный вектор
А – амплификация генов Ang-1 и VEGF165 с фрагментами линкеров.
Б – объединение генов Ang-1 и VEGF165, где 1 – Ang_3G4G3G3G (1541 п.н.); 2 – Ang_4G4G4G
(1537 п.н.); 3 – Ang_3G4G (1526 п.н.); 4 – 3G4G3G3G_VEGF (619 п.н.); 5 – 4G4G4G_VEGF (615
п.н.); 6 – 3G4G_VEGF (608 п.н.); 7 – Ang_3G4G3G3G_VEGF 1 реакция ОЕ ПЦР;
8 – Ang_4G4G4G_VEGF 1 реакция ОЕ ПЦР; 9 – Ang_3G4G_VEGF 1 реакция ОЕ ПЦР;
10 – Ang_3G4G3G3G_VEGF (2143 п.н.) 2 реакция ОЕ ПЦР; 11 – Ang_4G4G4G_VEGF (2137 п.н.)
2 реакция ОЕ ПЦР; 12 – Ang_3G4G_VEGF (2119 п.н.) 2 реакция ОЕ ПЦР.
6

7.

Проверка вставки генов Ang-1_VEGF165
в экспрессионный вектор pcDNA3.1(-)
А – Рестрикционный анализ плазмид с генами Ang-1_VEGF165. Б – ПЦР амплификация
плазмид с генами Ang-1_VEGF165, где 1 – Ang_3G4G3G3G_VEGF; 2 – Ang_4G4G4G_VEGF;
3 – Ang_3G4G_VEGF.
7

8.

Проверка вставки генов VEGF165_Ang-1
в экспрессионный вектор pcDNA3.1(-)
А – Рестрикционный анализ плазмид с генами VEGF165_Ang-1. Б – ПЦР амплификация
плазмид с генами VEGF165_Ang-1, где 1 – pcDNA3.1(-)_VEGF165_3G4G4G3G_Ang-1; 2 –
pcDNA3.1(-)_VEGF165_3PA_Ang-1; 3 – pcDNA3.1(-)_VEGF165_4G4G4G4G_Ang-1; 4 –
pcDNA3.1(-)_VEGF165_4G5G_Ang-1.
8

9.

Схема получения плазмидной ДНК в
препаративных количествах
Наработка бактериальных клеток с целевой плазмидной ДНК
Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
Фильтрация полученной суспензии
Ультрафильтрация и концентрирование
Удаление эндотоксина
Стерилизация препарата плазмидной ДНК
9

10.

Электрофореграмма проверки клеток на
наличие плазмиды
pcDNA 3.1-(-)-Ang-1_4G4G4G_VEGF165 и после
лизиса клеток
10

11.

Электрофореграмма проверки плазмиды
pcDNA 3.1(-)-Ang-1_4G4G4G_VEGF165 во время ультрафильтрации
1 – до промывки и концентрирования;
2 – до промывки после концентрирования;
3 – ретентат после промывки;
4 – ретентат после промывки и концентрирования
11

12.

Оптическая плотность
Электрофореграмма проверки плазмиды
pcDNA 3.1(-)-Ang-1_4G4G4G_VEGF165 после стерилизации
25
20
15
10
5
0
-5
250
300
350
400
нм
12

13.

Изменение порога ноцицептивной реакции оперированной конечности
крыс (самки, А; самцы, Б) на механический стимул, Me [25%; 75%]
140
135
130
125
120
115
110
105
100
95
90
85
80
75
70
65
Б
Ишемия
Ишемия + АФР
Ишемия + VEGF165/Ang-1
140
135
130
125
*# "&
* *
*
* *
*# "&
*
* *
*# "&
120
ПНР,г
ПНР,г
А
Ишемия
Ишемия + АФР
Ишемия + VEGF165/Ang-1
*
#&
*# "&
*"
115
*# "&
110
105
*
*
100
*# *
* * *
95
90
*
* *
85
80
75
-7
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
-7
0
7
14
21
28
35
42
49
Время, сут
– р<0,05 по сравнению со значениями до операции
# – р<0,05 по сравнению со значениями на 28-е сутки
“ – р<0,05 по сравнению с группой «Ишемия»
& – р<0,05 по сравнению с группой «Ишемия + АФР»
56
63
70
77
Время, сут
13

14.

Изменение площади отпечатка оперированной конечности крыс
(самки, А; самцы, Б), Me [25%; 75%]
А
Ишемия
Ишемия + АФР
Ишемия + VEGF165/Ang-1
2,0
2,2
1,8
2,0
Площадь отпечатка,см2
Площадь отпечатка,см2
Ишемия
Ишемия + АФР
Ишемия + VEGF165/Ang-1
Б
1,6
#"&
1,4
#
1,2
*"&
1,0
0,8
*
0,6
*
*
*
*
*
*
*
0,4
* #"&
1,8
1,6
1,4
#
1,2
*
1,0
*#
*
0,8
*
0,6
0,2
*
* * *
*
0,4
0,0
-7
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
-7
0
7
14
21
28
35
42
49
56
Время, сут
– р<0,05 по сравнению со значениями до операции
# – р<0,05 по сравнению со значениями на 28-е сутки
“ – р<0,05 по сравнению с группой «Ишемия»
& – р<0,05 по сравнению с группой «Ишемия + АФР»
63
70
77
Время, сут
14

15.

Изменение интенсивности отпечатка оперированной конечности крыс
(самки, А; самцы, Б), Me [25%; 75%]
Ишемия
Ишемия + АФР
Ишемия + VEGF165/Ang-1
105
Интенсивность отпечатка, а.е.
100
95
#"&
90
#" &
85
80
*
75
70
*
65
*
*
60
*
*
*
*
*
*
*
55
Б
50
45
40
Ишемия
Ишемия + АФР
Ишемия + VEGF165/Ang-1
105
Интенсивность отпечатка, а.е.
А
100
# "&
95
#"&
90
*
85
* * *
80
*
*
75
*
*
* *#
70
*
65
*
60
55
-7
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
-7
0
7
14
21
28
35
42
49
56
Время, сут
– р<0,05 по сравнению со значениями до операции
# – р<0,05 по сравнению со значениями на 28-е сутки
“ – р<0,05 по сравнению с группой «Ишемия»
& – р<0,05 по сравнению с группой «Ишемия + АФР»
63
70
77
Время, сут
15

16.

17.

Заключение
1.
2.
3.
4.
В ходе работы получены синтетические гены гибридных белков
Ang-1_VEGF165 и VEGF_Ang-1 с различными вариантами линкеров.
Создан ряд экспрессионных векторов, содержащих CMV-промоторэнхансер, необходимый для наработки гибридных белков в клетках
человека
Получен генотерапевтический препарат плазмидной ДНК pcDNA
3.1(-)-Ang-1_4G4G4G_VEGF165 в препаративных количествах
Осуществлён дизайн экспрессионных векторов и праймеров для
клонирования генов гибридных белков Ang-1_VEGF165 и
VEGF165_Ang-1 в экспрессионные вектора для наработки в
бактериальных клетках
17

18.

Публикации
Тезисные доклады конференций
1. Саченко, А.Б. Дизайн и анализ структуры гибридного
белка ANGPT1_VEGF165 для лечения ишемии нижних
конечностей / А.Б. Саченко, Е.А. Попичева, В.В. Щур,
А.В. Янцевич // Компьютерные технологии и анализ
данных: материалы IV Международной научнопрактической конференции, Минск, 25–26 апреля 2024 г. –
Минск: БГУ. – С. 269–271
18

19.

Научно-исследовательская работа
• Подана заявка на грант БРФФИ «Получение и
свойства рекомбинантного гибридного белка
ANG-VEGF165 – перспективного модулятора
ангиогенеза»
• Участвовала в написании патента «генноинженерная конструкция на основе кольцевой
ДНК, кодирующая гибридный мультидоменный
белок Ang-VEGF165»
19

English Русский Правила