Полимеразная_цепная_реакция_Как_одна_технология_изменила_мир

1.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ
ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ:
КАК ОДНА
ТЕХНОЛОГИЯ
ИЗМЕНИЛА МИР?

2.

2

3.

3

4.

Полимеразная Цепная Реакция

5.

-диагностика онкологических заболеваний
-диагностика генетических заболеваний
-идентификация личности
-диагностика патогенов в пище
-диагностика инфекционных заболеваний

6.

6
Хьелль Клеппе.
Артур Корнберг

7.

7
Фредерик Сенгер

8.

8
Кэри Мюллис.

9.

10.

Типичная реакционная смесь
10
1. Целевая ДНК - состоит из уникальной последовательности нуклеотидов. Например, при ПЦР-анализе
на герпес целью служит та часть ДНК, которая отличает вирус герпеса от других вирусов)
2. Два праймера — короткие нити из нуклеотидов, которые подходят к искомым нитям ДНК, как детали
пазла. Если праймеры не подошли, значит, целевой ДНК в биоматериале нет
3. ДНК-полимераза — фермент, который достраивает нить ДНК
4. Нуклеотиды (А, Т, Г, Ц), которые пойдут на строительство дочерних цепей ДНК
5. Буфер с рН~8.4 и определённой концентрацией ионов

11.

Эти компоненты смешивают в определённой пропорции в пробирке и
затем помещают в специальный прибор — амплификатор.
В нём обеспечивается поддержание температуры на определённом
уровне на каждой из трёх стадий ПЦР: денатурации (плавления),
отжига и элонгации (удлинения) цепей ДНК.
11

12.

Метод ПЦР основан на многократном избирательном
копировании определённого участка ДНК при помощи
ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом
происходит копирование только того участка, который
удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае,
если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от
амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с
помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие
участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых
ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3
kbp). С помощью смеси различных полимераз, с
использованием добавок и при определённых условиях длина
ПЦР-фрагмента может достигать 20 -40 тысяч пар
нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины
хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном
человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.
12

13.

13
Расходные материалы и оборудование для ПЦР.
а — ПЦР-пробирки.
б — Амплификатор C1000 Touch™ производства
Bio-Rad.

14.

14

15.

15

16.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ: ПРИНЦИП РАБОТЫ
16
НА ПРИНЦИПЕ РАЗДЕЛЕНИЯ И
УДВОЕНИЯ ДНК (РЕПЛИКАЦИИ)
ОСНОВАН МЕТОД ПЦР.
При ПЦР для инициации (узнавании
стартового кодона) синтеза дочерней цепи
используют праймеры — это короткие ДНКфрагменты,
комплементарные
началу
материнской цепи.
Присоединение праймеров позволяет
ДНК-полимеразе (ферменту, участвующему в
репликации ДНК) сесть на образовавшийся
двухцепочечный фрагмент и продолжить
синтез ДНК.
Выделение нужного ДНК участка для
амплификации
методом
ПЦР
осуществляется подбором двух различных
праймеров.

17.

17

18.

Этапы ПЦР
Полимеразная цепная реакция. На стадии денатурации цепи ДНК разъединяются, на следующем
этапе (отжиг) к ним присоединяются праймеры, а далее полимераза начинает свою работу — синтез
новых цепей ДНК (элонгация). И такой цикл повторяется многократно.

19.

19
Денатурация — это этап полимеразной цепной
реакции (ПЦР), на котором двухцепочечную ДНК-матрицу
нагревают до 94–96 °С на 0,5–2 минуты, чтобы цепи ДНК
разошлись, для того чтобы полимераза могла работать.
Эта стадия называется денатурацией, так как
разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК.
В таких условиях разрушаются водородные связи между
азотистыми основаниями параллельных цепей.

20.

Отжиг праймеров — это этап полимеразной цепной
реакции (ПЦР), на котором праймеры специфично
присоединяются к освободившимся цепям ДНК-матрицы с
разных сторон копируемого участка 3ˊ-концами друг к другу.
Чтобы праймеры могли комплементарно связаться
(отжечься) только с нужными участками, при их
конструировании необходимо учитывать такую важную
характеристику, как температура плавления (Тm). Это
расчётная температура, при которой половина праймеров
присоединяется к целевому участку ДНК. Отжиг проводят
при температуре на 1–5 °С ниже Tm, но не выше
оптимальной температуры работы полимеразы, то есть в
пределах 40–72 °С.

21.

21
Третий этап чаще проводят при температуре 72 °С — оптимальной для работы Taq-полимеразы.
Фермент присоединяется к комплексам праймер—матрица и, выхватывая из раствора нуклеотиды,
начинает по принципу комплементарности прилаживать их к 3ˊ-концу праймера. Удлинение, или
элонгация, новой цепи ДНК идет с максимальной скоростью 50–60 нуклеотидов в секунду (то есть
около 3000 в минуту).
Каждая вновь синтезированная цепочка ДНК становится, наравне со старой, матрицей для
синтеза в следующем цикле. Таким образом, количество нужного продукта в процессе реакции
возрастает экспоненциально. После прохождения всех циклов в реакционной смеси образуется
столько специфических двухцепочечных продуктов, что их «массив» можно увидеть невооруженным
глазом — проведя гель-электрофорез.
Через 25–30 циклов количество функциональных молекул полимеразы в реакционной смеси
истощается.

22.

Давайте ещё раз повторим все этапы ПЦР
22

23.

23

24.

Детекция продуктов ПЦР
24

25.

ПОСЛЕ ПЦР ОБЫЧНО ПРОВОДЯТ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ

26.

26

27.

ЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ПОЛЕ ЗАСТАВЛЯЕТ
АМПЛИФИЦИРОВАННЫЕ ОТРИЦАТЕЛЬНО
ЗАРЯЖЕННЫЕ ДНК-ФРАГМЕНТЫ ДВИГАТЬСЯ К
ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННОМУ ПОЛЮСУ.

28.

БОЛЕЕ МЕЛКИЕ И ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫЕ
ДНК-ФРАГМЕНТЫ ПРОБЕГУТ БОЛЬШЕЕ
РАССТОЯНИЕ ЗА ОТВЕДЁННОЕ ВРЕМЯ.
28

29.

29
В РЕЗУЛЬТАТЕ СМЕСЬ
ПЦР-ПРОДУКТОВ
РАЗДЕЛЯЕТСЯ НА ПОЛОСЫ,
КОТОРЫЕ
СТАНОВЯТСЯ
ВИДИМЫМИ
ПОД
ДЕЙСТВИЕМ
УЛЬТРАФИОЛЕТА.
СРАВНИВАЯ ИХ СО СТАНДАРТНЫМИ ОБРАЗЦАМИ, МОЖНО ВЫЧИСЛИТЬ МОЛЕКУЛЯРНУЮ МАССУ
ОБРАЗОВАВШИХСЯ В ХОДЕ ПЦР ДНК-ФРАГМЕНТОВ .

30.

Электрофорез - основной метод анализа продуктов реакции для
обнаружения амплифицированной ДНК и определения её размера.
Контроль – различные фрагменты ДНК с известным количеством
составляющих их нуклеотидов.
30

31.

Линия 1 – обнаружены ПЦР-фрагменты длиной приблизительно 1850
оснований.
Линия 2 и 4 – фрагменты длиной около 800 оснований.
Линия 3 – не выявлены искомые фрагменты, отрицательный результат
реакции.
Линия 5 – множественные линии сформировались потому, что
праймеры оказались комплиментарны к нескольким фрагментам ДНК
различной длины: около 550, 800 и 1500 оснований.
31

32.

32

33.

34.

Расшифровка генома человека
34

35.

Проект «Геном человека» — завершённый международный научноисследовательский проект, главной целью которого было определение
последовательности пар оснований, которые составляют ДНК человека, а также
выявление, картирование и секвенирование всех генов человеческого генома как
с физической, так и с функциональной точки зрения.
К 2003 году было секвенировано лишь 85 % генома человека, проект был
завершён в 2022 году, когда было достигнуто полное секвенирование генома
человека (не учитывая Y).
Последовательность человеческой ДНК сохраняется
в базах данных, доступных любому пользователю
через Интернет. Национальный центр биотехнологической
информации США хранят геномные последовательности в
базе данных известной как GenBank, вместе с
последовательностями известных и гипотетических генов
и белков.
Были разработаны компьютерные программы для анализа
данных, потому что сами данные без таких программ
интерпретировать практически невозможно.
35

36.

36

37.

Давайте вспомним
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственный процесс
многократного
копирования
(амплификации)
специфической
последовательности ДНК, осуществляемый in vitro.
Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза,
двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей
последовательность ДНК.
ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК «с нуля», ей
необходима короткая «затравочная» цепь НК, к которой она может начать
присоединять нуклеотиды. Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция
синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев
инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами
«затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов.
Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать»
строго определённый участок ДНК и связываться с ним согласно принципу
комплементарности.

38.

Каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трёх этапов:
1) денатурации, или «плавления» двуцепочечной ДНК: перед началом реакции
ДНК-мишень является двуцепочечной, при температуре 94-950 С комплиментарные
цепи ДНК расходятся - переходят в одноцепочечное состояние;
38
2) связывания (отжига) праймеров:
при температуре, оптимальной для
выбранных праймеров, происходит их
связывание
с
комплиментарным
участком матричной ДНК;
3) элонгации, или удлинения цепи:
ДНК-полимераза
присоединяет
нуклеотиды к праймерам, синтезируя
новые цепи ДНК, которые становятся
мишенью
для
праймеров
в
последующих циклах ПЦР.
Смена этапов каждого цикла осуществляется путём изменения температуры реакционной смеси.