Методы создания нокаутных мышей

1. Выведение нокаутной линии мышей

2. Что нужно для выведения нокаутной линии мышей?

• Псевдобеременные самки мышей
Зачем: вынашивание подсаженных эмбрионов
Как получить: Самку в возрасте от 8 недель
ссаживают с половозрелым вазэктомированным
самцом

3. Получение зигот

• 1) Естественное оплодотворение
Как: Ссаживание самок-доноров с самцами
производителями
Что получим: оплодотворённые яйцеклетки
(зиготы)
Плюсы: быстро и просто, близко к
физиологическим условиям, высокое качество
зигот, лучшая жизнеспособность
Минусы: Низкий контроль процесса, меньшее
количество зигот, необходимость содержания
самцов, нельзя использовать с замороженной

4. Получение зигот

• In vitro оплодотворение
Как: Из яичников супер-овулированных самок
извлекают незрелые или зрелые ооциты, которые
оплодотворяют спермой в лабораторных условиях,
после чего получают зиготы.
Плюсы: много зигот, можно использовать с
замороженной спермой, гибкий контроль условий
Минусы: сложно, гормональная стимуляция,
сниженное качество ооцитов

5. In vitro оплодотворение

• Супер-овуляция - гормональная стимуляция самок
для получения большего количества зрелых
ооцитов (яйцеклеток) в одном цикле, чем при
нормальной овуляции.
1) Инъекция гонадотропина сыворотки жеребых кобыл
(ГСЖК) – стимулирует рост фолликулов (аналог
ФСГ)
2) Инъекция хорионического гонадотропина (ХГЧ)
через 48 часов – запуск овуляции(имитация пика
ЛГ)
3) Забор клеток спустя 12-14 часов

6. In vitro оплодотворение: забор ооцитов

7. In vitro оплодотворение: забор спермы

8. In vitro оплодотворение ОНО САМОЕ

9. In vitro оплодотворение ОНО САМОЕ

10. Внесение ГИ конструкции в зиготы

1) Микроинъекции

11. Внесение ГИ конструкции в зиготы

2) Электропорация зигот

12. Внесение ГИ конструкции в зиготы

3) I-gonad (электропорация зигот в яйцеводе
живой беременной самки мыши)

13. Подсадка эмбрионов псевдобеременной самке

14. Получение поколения F0 и скриннинг

Отбор особей с инактивирующей
мутацией
Серия обратных скрещиваний с
мышами дикого типа