Изменения физико-химических характеристик эритроцитов во время лучевой терапии

1. Изменения физико-химических характеристик эритроцитов во время лучевой терапии

Павлов Александр Николаевич, научный сотрудник
лаборатории «Радиационные технологии»
Северо-Восточный университет им. М.К. Аммосова, Якутск

2. ВВЕДЕНИЕ

Рак шейки матки
Рак шейки матки (РШМ) занимает одно из первых мест в структуре заболеваемости злокачественными
новообразованиями у женщин. Ожидается еще более значительный рост заболеваемости РШМ,
несмотря на разработку новых комплексных профилактических мер по контролю РШМ, методов
ранней диагностики и развитие высокотехнологичных методов терапии. Кроме того, часто
наблюдаются рецидивы РШМ после различных видов радикального лечения, включая лучевую
терапию на ранних стадиях заболевания, а также явление метастазирования, что усложняет лечение и
негативно влияет на выживаемость пациенток Причины этих явлений на данный момент не имеют
четких объяснений. В связи с этим, существует необходимость в разработке новых исследовательских
подходов возникновения и развития заболевания, а также эффективности терапии на молекулярном и
клеточном уровнях. Особый интерес в данном контексте представляет изучение состояния крови,
которая является не только критически важной средой, но и активным участником патологических и
защитных процессов.
Лучевая терапия, являясь одним из основных методом лечения РШМ, оказывает системное
воздействие на морфофункциональное состояние клеток крови и кроветворную систему, в частности
на эритроциты, что требует глубокого и целенаправленного исследования.
Примечание

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты и методы исследования
В качестве объектов исследования были использованы образцы венозной крови 50 пациентов с
диагнозом рак шейки матки полученные до, во время и после лучевой терапии . Возраст пациентов от 45 до 55 лет. Пациенты проходили фракционную ЛТ в два этапа и получили суммарную дозу 50 Гр:
• дистанционная ЛТ с использованием внешнего луча ускорителя Elekta Synergy, 6-18 МэВ
(Швеция)
• брахитерапия с использованием прибора MultiSourse HDR с источником 60Co (Германия).
Венозную кровь собирали в пробирки с K3-ЭДТА. Мазки крови подготавливались лаборантом
стандартным методом [1].
1. [Corrons J. L. V. et al. Guidelines for blood smear preparation and staining procedure for setting up an external quality assessment scheme for blood smear
interpretation. Part I: Control material //Clinical Chemistry & Laboratory Medicine. – 2004. – Т. 42. – №. 8.]

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты и методы исследования
• Объектами изучения с применением электронного микроскопа и атомно-силового микроскопа были сухие
мазки не фиксированной цельной крови на подложках из стекла и восстановленного оксида графена с
наночастицами серебра.
• КР-спектры снимали с капли цельной невысушенной крови, нанесенной на предметное стекло.
• Объектами исследования на ОДТ использовался раствор периферической крови. Образцы крови смешивали
с изотоническим раствором Аллена в соотношении 1:100 (контроль) и с гипотоническим раствором Алена
(опыт).
• Силовая спектроскопия проводилась на Атомно-силовом микроскопе. Исследовались высушенные мазки
венозной крови нанесенные на предметное стекло.
Примечание

5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились в соответствии с этическими принципами медицинских исследований с участием
людей, принятыми 18-й Генеральной ассамблеей ВМА, Хельсинки, Финляндия, июнь 1964 г., с поправками,
внесенными 52-й Генеральной ассамблеей ВМА, Эдинбург, Шотландия, октябрь 2000 г., также после получения
одобрения локального комитета по биомедицинской этике Северо-Восточного федерального университета
имени Аммосова (протокол № 13 от 4 апреля 2018 г., решение № 2). Все пациенты дали письменное
информированное согласие.
При выполнении исследования руководствовались «Правилами гуманного обращения с лабораторными
животными» от 6.04.1973, № 1045-73.
Эксперименты, представленные в данной работе, проводились в лабораториях Северо-Восточного
федерального университета имени М.К. Аммосова, Московского государственного университета имени М.В.
Ломоносова, Регионального центра инжиниринга Технопарк «Якутия», Всероссийского научноисследовательского института оптико-физических измерений.
Примечание

6. НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫЕ ПОДЛОЖКИ

Для отвода накапливаемого на образце
заряда при сохранении поверхности клеток
и прикрепленных на их поверхности НРС мы
предлагаем использование подложек из
нанокомпозитных
материалов
из
восстановленного оксида графена и оксида
графена с наночастицами серебра, которые
хорошо зарекомендовали себя в качестве
материалов с высокой проводимостью.
Для улучшения качества изображений,
получаемых
методом
СЭМ
без
использования
напыления
были
изготовлены подложки из восстановленного
оксида графена (ГО). Суспензию ГО
получили
путем
окисления
графита
модифицированным методом Хаммерса [2].
Рис. 1. СЭМ-изображение поверхности SiO₂ со скоплением наночастиц серебра:
точки S1 и S2 соответствуют областям, в которых проводились измерения
спектров рентгеновского энергодисперсионного микроанализа (a); спектр
энергодисперсионного микроанализатора в точке S1 (b); СЭМ-изображение
поверхности ОГ с наночастицами серебра (c) и размеры сформированных в ОГ
наночастиц серебра (d)
2. Mohan V. B. et al. Characterisation of reduced graphene oxide: Effects of reduction variables on electrical conductivity //Materials Science and
Engineering: B. – 2015. – Т. 193. – С. 49-60.

7. НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫЕ ПОДЛОЖКИ

Нанокомпозит с наночастицами серебра
демонстрирует в 40–50 раз меньшие
значения
удельного
поверхностного
сопротивления по сравнению с GO во всем
диапазоне от 80 до 4500 К. Снижение
сопротивления
оксида
графена
при
введении наночастиц серебра может быть
обусловлено увеличением концентрации
носителей заряда и улучшением механизма
переноса заряда [3].
(А) Спектры КРС частично восстановленного оксида графена (rGO) и нанокомпозита ОГ с
СНЧ (AgGO) (В) Спектры фотолюминесценции суспензий оксида графена (GO),
наночастиц серебра (Ag) и оксида графена с наночастицами серебра (AgGO)
(А) Отношение спектров пропускания нанокомпозита ОГ с СНЧ и исходного ОГ (В)
Зависимость слоевых сопротивлений оксида графена и нанокомпозита ОГ с СНЧ
от обратной температуры
3. Li L. et al. Inkjet-printed highly conductive transparent patterns with water based Ag-doped graphene //Journal of Materials Chemistry A. – 2014. – Т.
2. – №. 44. – С. 19095-19101.

8. НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫЕ ПОДЛОЖКИ

СЭМ-изображения нанообъектов на поверхности дисморфного эритроцита
на подложке из восстановленного нанокомпозита GO-Ag, увеличение 23 000
(a) и на сухом чистом полированном стекле, увеличение 23 000 (b) при раке
шейки матки.
2. Mohan V. B. et al. Characterisation of reduced graphene oxide: Effects of reduction variables on electrical conductivity //Materials Science and
Engineering: B. – 2015. – Т. 193. – С. 49-60.

9. АВТОМАТИЗАЦИЯ

Обработка изображений полученных на сканирующем электронном микроскопе
Проведение морфологического анализа вручную сопряжено с существенными временными затратами,
высокой субъективностью и низкой эффективностью, что делает рутинный анализ непрактичным для
обработки больших массивов данных. В связи с этим задачей нашей работы становится разработка
автоматизированного метода анализа. Основная сложность автоматизации заключается в специфике
СЭМ-изображений. В отличие от методов флуоресцентной микроскопии, где объекты исследования
часто имеют выраженный контраст относительно фона, СЭМ-изображения формируются на основе
топографического и композиционного контраста и характеризуются низким отношением сигнал-шум и
неоднородным фоном, обусловленным вариациями в токе зонда или топографии образца. Кроме того,
наблюдаются значительные вариации в качестве изображений, уровне контрастности, яркости и других
параметрах съёмки, обусловленные как условиями подготовки образцов, так и настройками самого
микроскопа.
Обработку и анализ изображений выполняли с применением следующего программного обеспечения:
первичную обработку изображений проводили в программе ImageJ (National Institutes of Health, США);
для сегментации изображений методом машинного обучения использовали платформу Ilastik
(European Molecular Biology Laboratory, Германия); алгоритм определения размеров эритроцитов был
реализован на языке Python (Python Software Foundation, Нидерланды) с использованием открытых
библиотек обработки изображений.
Примечание

10. АВТОМАТИЗАЦИЯ

Обработка изображений полученных на сканирующем электронном микроскопе
График перепада интенсивности (усл.ед.) на границе клетки.
A) Автоматическая сегментация B) Результат сегментации C) Автоматическое
определение нормоцитов
Примечание
A) Перевод исходного изображения в бинарный формат B) Применение операции
дилатации к изображению A C) Применение операции эрозии к изображению B
A) Исходное изображение B) Результат определения контуров и наложения кругов

11. ИССЛЕДОВАНИЕ РАЗМЕРОВ ЭРИТРОЦИТОВ

Сравнение размеров эритроцитов в ходе лучевой терапии
На промежуточном этапе ЛТ (14 Гр)
наблюдалось достоверное уменьшение
средних размеров эритроцитов по
сравнению с исходным состоянием. По
завершении же курса лечения при общей
дозе 40 Гр средний размер клеток
увеличивался по сравнению со средним
размером на промежуточном этапе ЛТ.
Обнаруженный нелинейный характер
изменений,
вероятно,
является
проявлением
адаптационного
ответа
клеток на фракционированное облучение.
Первоначальное уменьшение размеров
может быть связано с непосредственным
цитотоксическим эффектом радиации и
стресс-индуцированным
уменьшением
размеров клеток.
Примечание
Распределение эритроцитов по размерам до, во время и после
лучевой терапии

12. ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОРАЗМЕРНЫХ ЧАСТИЦ

Исследование нанроазмерных частиц на сканирующем и атомно-силовом
микроскопах
Обнаружена
прямая
корреляционная
зависимость между количеством экзосом
и
изменениями
среднего
размера
эритроцитов (коэффициент Пирсона = 0.90): увеличение количества экзосом на
промежуточном этапе ЛТ сопровождалось
уменьшением
среднего
диаметра
эритроцитов, тогда как нормализация
количества везикул к концу лечения
коррелировала
с
восстановлением
размеров
эритроцитов.
Это
может
свидетельствовать о том, что экзосомы
имеют эритроцитарную природу, и их
образование
является
следствием
воздействия ионизирующего излучения на
эритроциты и кроветворную систему.
Примечание
Распределение
везикул по количеству и
размерам
Корреляция между размером эритроцитов
и количеством наночастиц
(a) АСМ-изображение эритроцита с наночастицами
(b) Измерение высоты наночастиц.
(линейные размеры, мкм).

13. КР-СПЕКТРОСКОПИЯ

Исследование изменений в гемоглобине в ходе лучевой терапии
Образование везикул при проведении
лучевой терапии свидетельствует о
возможном
воздействии
ионизирующего
излучения
на
механизмы
везикулообразования.
Это
прямое
влияние
может
реализоваться как через прямое
повреждение клеточных структур, так
и
опосредованно,
через
окислительный стресс. Ключевым
звеном является радиолиз воды и
повреждение гемоглобина, ведущее к
образованию
метгемоглобина
и
генерации супероксид-радикалов.
Для исследования состояния
гемоглобина мы использовали метод
КР- и ИК- спектроскопии.
Примечание
Сравнение усредненных КР-спектров Соотношение величин интенсивностей
Полос КР-спектров
мазков крови контрольной группы с
КР-спектрами мазков крови пациентов с
РШМ до и после ЛТ

14. КР-СПЕКТРОСКОПИЯ

Сравнение соотношений интенсивностей характерных полос КР-спектра
Отношение пиков
Контроль
До ЛТ
После ЛТ
1,59
-
-
0,87
+
-
0,52
-
+
0,12
-
-
0,50
+
+
-
I1355/(I1355+I1375)
(I1355/I1550)/(I1375/I1580)
Сродство Гб к лигандам (в первую очередь, О2).
3,18
I1618/I1580
Относительное число комплексов Гб с NO(I).
Отношение симметричных колебаний –СН метиленовых групп аминокислот к
несимметричным колебаниям. Указывает на изменение липидной текучести
мембраны. Чем выше соотношение, тем ниже плотность упаковки.
Вклад колебаний Н метиленовых групп аминокислот, определяется
конформационной подвижностью. При увеличении параметра увеличивается
упорядоченность аминокислот и плотность упаковки аминокислот.
Отношение вклада колебаний симметричных концевых метиленовых групп к
симметричным колебаниям метиленовых групп аминокислот. Характеризует
изменение полярности окружения аминокислот. Чем выше соотношение, тем ниже
полярность окружения.
0,34
+
0,28
+
+
0,85
+
-
4,20
-
-
I1375/I1127
I1375/I1172
I1375/I1580
I1580/I1550
I2850/I2880
I2880/I2930
I2930/I2850
Примечание
Интерпретация
Колебания боковых радикалов CbCH3 в гемопорфирине, зависит от белкового
окружения и конформации глобина возле гемопорфирина вклад боковых –СН3
групп колебаний полуколец пиррола в гемопорфирине, выраженных при изменении
конформации глобина в непосредственной близости от гема, характеризует
выраженность симметричных и ассиметричных колебаний пиррольных полуколец
(изменение величины соотношения характеризует изменение конформации Гб из T
(дезоксигемоглобин) в R (оксигемоглобин). Чем оно выше, тем выше вероятность
нахождения гема в R-форме.
Групповые колебания связей полуколец пиррола в гемопорфирине, зависит от
белкового окружения глобина возле гемопорфирина (характеризует выраженность
симметричных и ассиметричных колебаний пиррольных полуколец). Изменение
соотношения, может быть связано с конформационными изменениями пирролов.
Относительная способность Гб выделять лиганды (в том числе, О2), чем оно выше,
тем меньше способность выделять лиганды.
Вклад колебаний метиновых мостиков между пирролами в гемопорфирине,
выраженных при деформации макроцикла - где гемопорфирин растянут и
деформирован, либо имеет компактную недеформированную конформацию
(характеризует сродство Гб к лигандам, в частности к кислороду). Чем оно выше,
тем выраженнее сродство к лигандам.
Относительное количество комплексов дГб.

15. ОПТИЧЕСКАЯ ТОМОГРАФИЯ

Алгоритм обработки проекций получаемых на оптическом дифференциальном
томографе
Для
формирования
физиологически
изотонических условий, предотвращающих
гемолиз и изменения морфологии эритроцитов,
применяли изотонический раствор Аллена в
соотношении 1:100 при комнатной температуре