Краткое введение в процесс получения лентивирусного вектора

1. Краткое введение в процесс получения лентивирусного вектора

2.

Реактивы и расходные материалы для сборки вирусного вектора:
o Упаковочные клетки 293Т
o Ростовая среда DMEM (4.5 г/л глюкозы, L- Glutamine, 10% FBS,
опционально – антибиотики) для культивирования 293Т
o Лентивирусные плазмидные ДНК
o Реагент для трансфекции (Липофектамин или аналоги)
o Среда OptiMEM или альфа-МЕМ
o Культуральная посуда (для сборки небольшого масштаба,
например, подойдет плашка 6-well)
Реактивы и расходные материалы для проведения лентивирусной
трансдукции:
o Клетки, которые мы желаем трансдуцировать и ростовая среда, на
которой они идут
o Лентивирусный вектор с известным титром
o Полибрен
o Сыворотка, инактивированная нагреванием

3.

Последовательность действий
• Важно, чтобы клетки 293Т образовали монослой плотностью около 90%
• Если клетки растут группами, между которыми существуют обширные
пустоты, с большой вероятностью нас может постигнуть неуспех
Ко-трансфекция
День 0
Смена среды
День 1
Сбор 1 вирусного стока,
добавление свежей среды
День 2
В зависимости cоcтояния клеток
добавляем DMEM с 2% или 5% FBS
Сбор 2 вирусного стока, заморозка
День 3

4. Котрансфекция

• Rev 19%
• RRE 37%
• VSV-g 7%
• Трансген 37%
+ Липофектамин
Упаковочные
плазмиды
Процентные соотношения подобраны
эмпирически на основе опыта
поколений
293Т
Плазмиды хорошо повортексировать перед
использованием

5.

Котрансфекция
Lipofectamine 3000
Проб
ирка
1
OptiMEM
Все 4 плазмиды с
прошлого слайда +
P3000 реагент
Проб
ирка
2
OptiMEM
+ Lipofectamine 3000
• Среду с плазмидами и P3000 хорошо повортексировать
• МЕДЛЕННО, ПО КАПЛЯМ добавить содержимое
пробирки номер 1 в пробирку номер 2
• Подождать 15-20 мин и добавить к упаковочным клеткам

6. Определение титра

o Определяем количество флуоресцирующих клеток через
48 часов после трансдукции методом цитометрии и
микроскопии
o Рассчитываем титр по формуле на следующем слайде