ЛЗ Введение в ЦГЭ

1. микроскопическая техника. техника изготовления гистологического среза

МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ
ТЕХНИКА.
ТЕХНИКА ИЗГОТОВЛЕНИЯ
ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО
СРЕЗА

2. Название прибора произошло от двух греческих слов: miKros – означает малый; skopeo – смотрю.

НАЗВАНИЕ ПРИБОРА ПРОИЗОШЛО ОТ ДВУХ
ГРЕЧЕСКИХ СЛОВ: MIKROS – ОЗНАЧАЕТ МАЛЫЙ;
SKOPEO – СМОТРЮ.
Микроскоп – оптический прибор,
предназначенный для изучения
прозрачных объектов, невидимых
простым глазом.
Микроскоп – оптический прибор для
получения увеличенного изображения
мелких объектов и их деталей, невидимых
невооружённым глазом.

3.

Оптические (световые) – используются для изучения прозрачных или
непрозрачных препаратов. Основу прибора составляет комплект линз,
входящих в состав окуляра и объектива. Устройства обеспечивают
увеличение до 2000 крат, позволяя рассмотреть частицы 0,20 мкм.
Электронные - ПЭМ, или просвечивающий электронный микроскоп; РЭМ, или
растровый электронный микроскоп; туннельный сканирующий электронный
микроскоп, или СТМ.
Рентгеновские – устройства, использующие для получения картинки
электромагнитное излучение (длина волны 0,01-1 нм) и набор датчиков. По
степени увеличения и разрешающей способности они занимают позицию
между оптическими и электронными устройствами. Рассматривая основные
типы микроскопов, важно учитывать, что все приборы, кроме оптических,
являются специализированными и применяются исключительно в
лабораторных условиях. Электронные – устройства формируют изображение
с помощью направленного пучка электронов и улавливающих его линз. Такие
модели способны увеличивать изучаемый препарат до 1 млн крат.
Сканирующие зондовые микроскопы – используя специальный датчик,
устройство исследует поверхность в мельчайших деталях (вплоть до
атомарной структуры) и формирует трехмерное изображение выбранного
участка. Такой тип современных микроскопов используется достаточно
редко, поскольку интерпретировать полученные данные сложно.

4. Виды оптических микроскопов

ВИДЫ ОПТИЧЕСКИХ МИКРОСКОПОВ
Цифровые – позволяют выводить полученное изображение на экран, делать снимки и
записывать видео. Камера может быть вспомогательной опцией или заменителем стандартной
оптики.
Стереомикроскопы – обеспечивают сравнительно небольшое увеличение (до 40 крат), зато
позволяют наблюдать поверхность крупных предметов (до 100 г).
Биологические – применяются для изучения прозрачных и полупрозрачных образцов
органического или неорганического происхождения. Такой тип микроскопов применяется в
медицине, ветеринарии, археологии, пищевой промышленности и других сферах деятельности.
Люминесцентные – позволяют проводить исследования, основанные на флуоресценции
отдельных веществ. Снабжены мощной коротковолновой подсветкой, светоотделительной
пластиной и набором светофильтров. Учитывая, какие виды микроскопов бывают еще,
люминесцентные приборы считаются узкоспециализированными.
Поляризационные – сложные модели, используемые для изучения неоднородностей структуры
материалов. Этот вид оптического микроскопа применяется в медицине, минералогии,
петрологии.
Металлографические – используют отраженный свет и особую систему линз для изучения
поверхности непрозрачных материалов. Чаще всего находят свое применение в
машиностроении, археологии, металлургии, геологии.
Криминалистические – назначение этого вида микроскопов состоит в проведении
баллистических исследований, изучении улик с мест преступления. Особенности конструкции
позволяют одновременно рассматривать и сравнивать два образца.

5. Подвиды световых микроскопов. Современные оптические приборы классифицируют:

ПОДВИДЫ СВЕТОВЫХ МИКРОСКОПОВ.
СОВРЕМЕННЫЕ ОПТИЧЕСКИЕ ПРИБОРЫ
КЛАССИФИЦИРУЮТ:
1.По классу сложности на исследовательский
(лабораторный), рабочий и школьный (учебный)
микроскоп.
2. По области применения на биологические,
хирургические и технические.
3. По видам микроскопии на приборы отраженного и
проходящего света, фазового контакта,
люминесцентные и поляризационные.
4. По направлению светового потока на
инвертированные и прямые.

6.

1.Оптические микроскопы: Стереомикроскоп;
Сравнительный; Поляризационный; Двухфотонный;
Инвертированный; Эпифлуоресцентный.
2.Электронные микроскопы:
Просвечивающий электронный микроскоп;
Сканирующий электронный микроскоп;
3. Сканирующие зондовые микроскопы:
Атомно-силовой микроскоп; Сканирующая оптическая
микроскопия ближнего поля; Сканирующий
туннельный микроскоп.
4. Сканирующие акустические микроскопы
5. Рентгеновские микроскопы

7.

8. Модели микроскопов: Биомед_ломо_оlYmpus_ nikon

МОДЕЛИ МИКРОСКОПОВ:
БИОМЕД_ЛОМО_ОLYMPUS_
NIKON
Модель
Тип
Объективы
Окуляры
Биомед С1
монокуляр
10х, 40х, 100х
5х, 10х, 16х
Биомед С2
вар.4
монокуляр
4х, 10х, 40х,
100х
WF 10x
Биомед - 1
би-/тринокуляр
4х, 10х, 40х,
100х
WF 10x, 16х
Биомед - 2
тринокуляр
4х, 10х, 40х,
100х
WF 10x, 16х
ЛОМО: Микмед1, вар.1.20
монокуляр
10х, 40х, 100х
10х
Микмед-1,
вар.2.20
бинокуляр
10х, 40х, 100х
10х
Микмед-1,
вар.6
бинокуляр
10х, 20х, 60х,
90х
5х , 7х
Микмед-1,
вар.2
бинокуляр
4х, 10х, 40х,
100х
10х, 15х
Olympus: СХ21
бинокуляр
4х, 10х, 40х,
100х
10х
СХ31
бинокуляр
4х, 10х, 40х,
100х
10х
СХ41
би-/тринокуляр
4х, 10х, 40х,
100х
10х
Nikon: YS 100
бинокуляр
4х, 10х, 40х,
100х
10х

9.

Модель
Тип
Объектив
ы
Окуляры
Тринокуляр
10х, 20х,
40х, 100х
10х, 16х
Микмед2, вар.11
Бинокуляр
10х, 20х,
40х, 100х
10х
Микмед1, вар.12
Бинокуляр
10х, 20х,
40х, 100х
6,3х , 10х,
15х со
шкалой
СХ31
Бинокуляр
4х, 10х,
40х, 100х
10х
СХ41
би/тринокуляр
4х, 10х,
40х, 100х
10х
би/тринокуляр
4х, 10х,
40х, 100х
10х
Биомед:
Биомед
2Л
ЛОМО:
Olympus:
Nikon:
200F
ЛЮМИНЕСЦЕНТ-НЫЕ
МИКРОСКОПЫ

10. Поляризационный микроскоп

Модель
Тип
Объективы
Окуляры
Полам Р211М
бинокуляр
2,5х, 10х, 10х
60х
Полам Р213М
тринокуляр
2,5х, 10х, 10х
60х
Полам
Р-312
тринокуляр
4,7х, 9х,
21х, 40х,
95х
ЛОМО:
ПОЛЯРИЗАЦИОННЫЙ МИКРОСКОП
6,3х, 10х

11. Инвертированные микроскопы

Инвертированным называется микроскоп, обладающий особой
«перевернутой» конструкцией. Особенность такого приспособления
кроется в том, что он позволяет проводить исследования с нижней
стороны объекта. Обладая рядом отличительных особенностей,
приспособление незаменимо во многих сферах деятельности.
Модель
Тип
Объективы
Окуляры
бинокуляр
2,5х,
6,3,
10х,
20х
10х,
15х
СХ31
бинокуляр
4х, 10х,
20х, 100х
5х,10х,
12,5х,
15х
СХ41
би/тринокуляр
4х, 10х,
20х, 100х
5х,10х,
12,5х,
15х
би/тринокуляр
4х, 10х,
20х, 40х
5х,10х,
12,5х,
15х
ломо
Биола
м П21
Olympus:
Nikon:
TS100
ИНВЕРТИРОВАННЫЕ МИКРОСКОПЫ

12. стереомикроскопы

Тип
Рабочее
состояние
Увеличение
бинокуляр
105 мм
до 80х
бинокуляр
95 мм
до 100х
Серия SZ
би-/тринокуляр
до 110 мм от 3,4 до
330х
Серия SZX
би-/тринокуляр
до 198 мм до 675х
SM-5
бинокуляр
110 мм
От 10х до
60х
SMZ-
би-/трино-
115 мм
От 4х до
Модель
SM
Биомед:
Биомед
МС-1
Лыткарин
а:
МБС-10
Olympus:
Nikon:
СТЕРЕОМИКРОСКОПЫ

13.

Микроскопы «Левенгук». В 2002 году в Америке появилась новая компания,
занимающаяся производством оптических приборов. В ассортиментном перечне ее
продукции находятся микроскопы, телескопы и бинокли. Все эти приборы отличает
высокое качество изображения. Головной офис и отдел разработок компании
располагаются в США, в городе Фримонде (Калифорния).
Микроскоп Levenhuk обладает обширными функциональными возможностями.
Например, учебный прибор начального уровня может быть присоединен к
компьютеру, а также он способен выполнять видеосъемку проводимых исследований.
Таким функционалом оснащена модель Levenhuk D2L.

14. Техника изготовления гистологического препарата.

ТЕХНИКА ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО
ПРЕПАРАТА.
Для микроскопического изучения исследуемый объект должен удовлетворять
двум основным условиям:
1) он должен быть прозрачным;
2) его структуры должны быть контрастны, т.е. отличаться одна от
другой показателем преломления. Большинство животных
тканей не удовлетворяет этим условиям, поэтому их приходится
подвергать более или менее сложной обработке, чтобы
приготовить для микроскопического изучения гистологический
препарат. Гистологические препараты бывают временные,
предназначенные для однократного изучения, и постоянные,
которые могут храниться длительное время и подвергаться
исследованию многократно. Постоянные микроскопические
препараты удовлетворяют еще одному условию:
неизменяемости при длительном хранении.

15.

16. Этапы изготовления гистопрепарата

ЭТАПЫ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОПРЕПАРАТА
1. Взятие материала (кусочка ткани или органа) для
приготовления препарата. При этом учитываются следующие моменты:
-) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя
животного, а при возможности — от живого объекта (биопсия), чтобы лучше
сохранились структуры клетки, ткани или органа;
-) забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не
травмировать ткани;
-) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог
проникнуть в толщу кусочка;
-) обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование
органа, номер животного, дата забора и т. д.).
МАТЕРИАЛ – ТРУПНЫЙ; БОЕНСКИЙ (крс, мрс, кролики, утки, гуси – 24ч.,
куры, индейки, цыплята -18ч., свиньи – 4ч.; ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ;
ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫЙ – при несчастных случаях (травмах, переломах,
ожогах); удаленный при оперативных вмешательствах; биопсийный;
соскобы; мазки; отпечатки; пунктанты.
Мазки – сухие и влажные: крови, лимфы, ликвора и синовиальной
жидкости.

17. Кусочек ткани для проведения исследования берут у пациента методом биопсии. Она бывает нескольких видов:

КУСОЧЕК ТКАНИ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ
ИССЛЕДОВАНИЯ БЕРУТ У ПАЦИЕНТА МЕТОДОМ
БИОПСИИ. ОНА БЫВАЕТ НЕСКОЛЬКИХ ВИДОВ:
Аспирационная при помощи иглы (прокол ткани с последующим извлечением
“столбика” клеток);
Аспирационная из полых органов, когда игла вводится через естественное
отверстие (например, при биопсии слизистой оболочки матки);
Инцизионная — на исследование отправляют часть иссеченного органа после
хирургической операции;
Эксцизионная — изучение полностью удаленного органа (например, после
удаления почки);
Кюретаж — выскабливание эндометрия с последующим его анализом;
Щипцевая — осуществляется совместно с эндоскопическим исследованием,
когда с помощью специального оборудования вводится микро щипчики,
которыми получают материал.
Похожим методом является “открытая” биопсия — забор клеток без
внедрения в ткани или полости (смывы, соскобы, мазки). Такое
исследование называют цитологией.

18. В экспериментальной биологии применяется метод гистохимического изучения культуры клеток и тканей:

В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ
ПРИМЕНЯЕТСЯ МЕТОД ГИСТОХИМИЧЕСКОГО
ИЗУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ:
- первичные культуры, получаемые из органов
различных животных и эмбрионов человека
(почек, семенников, легких, печени, яичника,
матки, щитовидной железы и т.д.);
вторичные – клеточные линии и штаммы (этот
метод позволяет выяснить взаимо-отношения
между клетками и вирусами, установить
закономерности тканевой и клеточной
дифференцировки в патологии).

19.

2.Фиксация материала — необходима для
остановки обменных процессов и сохра-нения
структур от распада. Фиксация дости-гается чаще
всего погружением кусочка в фикси-рующие жидкости,
которые могут быть простыми — спирты и формалин и
сложными — раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и др.
Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым
приостанавливает обменные процессы и сохраняет
структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация
может достигаться также замораживанием
(охлаждением в струе углекислого газа, жидким азотом
и др.). Продолжительность фиксации подбирается
опытным путем для каждой ткани или органа.

20. 3. Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, органические смолы, желатин) или замораживание для последующего

3. ЗАЛИВКА КУСОЧКОВ В УПЛОТНЯЮЩИЕ
СРЕДЫ (ПАРАФИН, ЦЕЛЛОИДИН, ОРГАНИЧЕСКИЕ
СМОЛЫ, ЖЕЛАТИН) ИЛИ ЗАМОРАЖИВАНИЕ ДЛЯ
ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТОНКИХ
СРЕЗОВ.
4. Приготовление срезов на специальных
приборах (микротоме санном, ротационном, замораживающем или
ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой
микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной
микроскопии — монтируются на специальные сеточки.
Типы микротомов:
Санный (МС-2) – для получения парафиновых и целоидиновых срезов.
Ротационный (МПС-2)– для получения серийных срезов материала,
залитого в парафин.
Замораживающий (ТОС-2) – для замораживания объекта, что позволяет
резать нефиксированный, свежий материал.

21.

5. Окраска срезов или их контрастирование
(для электронной микроскопии). Перед окраской срезов
удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается
контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на
основные, кислые, нейтральные и специальные.
Структуры срезов, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями (эозин,
конго красный, кислый фуксин, разные оранжевые, пикриновая кислота,
лихтгрюн, эритрозин и др.), называют оксифильными (ацидофильными);
основными красителями (гематоксилин, метиленовый синий, толуидиновый
синий, азур, тионин, бисмарк коричневый) – базофильными.
Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители,
являются нейтрофильными (гетерофильными).
Специальные красители взаимодействуют лишь с определёнными
веществами, например, судан III и осьмиевая кислота выявляют жиры и
жироподобные вещества.
Просветление срезов (в ксилоле, толуоле).

22.

Различают несколько типов гистологического окрашивания:
1 – прогрессивное – срезы находятся в красителе до тех пор,
пока не достигнут требуемого уровня окрашивания;
2 – регрессивное – срезы перекрашивают, а затем доводят до
требуемой окраски путем отмывания в соответствующей
жидкости, что позволяет более отчетливо выделить отдельные
элементы тканей;
3 – прямое (субстантивная) – окрашивание объекта
непосредственно в растворе красителя;
4 – прямое (протравка, аджективная) – срез окрашивают
нужным красителем лишь после предварительной обработки
специальными красителями.
В зависимости от того, какие структуры окрашивают красители,
их разделяют на две группы: ядерные (основные красители) и
цитоплазматические (кислые красители).

23.

Способность гистологических структур опреде-ленным
образом окрашиваться теми или иными красителями
называется тинкториальными свойствами.
Структуры, не реагирующие с красителями, называются
хромофобными.
Окрашивающиеся структуры являются хромофильными
(базофильными, оксифильными).
В ряде случаев для характеристики тинкториальных свойств
используется название красителя, с которым реагируют или не
реагируют гистологические структуры. Например,
пиронинофильные — окрашенные пиронином, суданофобные —
не окрашенные суданом и т. п.
Иногда структуры, имеющие специфический химический состав,
меняют при окрашивании цвет красителя. Такое тинкториальное
свойство называется метахромазией.

24.

6. Заключение срезов в консервирующую среду
(канадский бальзам, пихтовый бальзам,
полистерол), закрытие покровным стеклом.
Так как после окраски срезы обычно находятся
в воде, то перед заключением их проводят
через спирты: 70, 96%-ные и абсолютный.
Правильно приготовленные препараты,
заключенные в бальзам и защищенные от
солнечного света, могут без изменения
храниться многими десятилетиями.
Для заключения временных препаратов можно
использовать глицерин.

25.

Гистологические препараты в зависимости от
целей исследования могут быть временные,
предназначенные для однократного изучения, и
постоянные, которые могут сохраняться
длительное время. В качестве среды, в которую заключают временный
препарат, используют глицерин или воду.
Временные готовят из прозрачных объектов, например соскоб с внутренней
поверхности слизистой оболочки щеки, мазок крови и т. д. Объект для исследования
помещают на предметное стекло, на которое нанесена капля воды, физиологического
раствора или глицерина, накрывают покровным стеклом и наблюдают под
микроскопом. Для получения контрастного объекта иногда прибегают к слабому
окрашиванию, используя безвредные (инертные) красители: отвары ягод черники,
смородины, корнеплода свеклы, чешуи лука или чернила, растворы йода,
метиленового синего и т. д. Временные гистологические препараты просты в
изготовлении, но не пригодны для тщательного изучения объекта, так как они быстро
высыхают, неконтрастны, не имеют специфической окраски органоидов клетки.
Временные препараты чаще всего используются как предварительные.

26.

Изготовление гистопрепарата - мазка из эпителиальных
клеток слизистой оболочки ротовой полости (щеки).
1.Взятие материала для изготовления гистопрепарата. Потереть слизистую щеки
ватной палочкой. Соскоб размазать на предметном стекле, чтобы получился
равномерный мазок.
2.Окраска
2.1 Мазок зафиксировать 70° спиртом в течение пяти минут.
2.2 Спирт смыть дистиллированной водой.
2.3 Окрасить раствором гематоксилина - пять минут.
2.4 Краску слить и смыть водопроводной водой.
2.5 Окрасить 0,1% раствором эозином - пять минут.
2.6 Краску слить и смыть дистиллированной водой.
2.7 Зафиксировать 96° спиртом, высушить.
3.Для изготовления временного препарата - капнуть глицерин.
Для изготовления постоянного препарата - капнуть бальзам.
4. Закрыть покровным стеклом, поставить грузик . Препарат с бальзамом должен
сохнуть 5-10 дней.
5. Временный препарат, заключенный в глицерин можно сразу рассмотреть под
микроскопом.

27.

28. Клетки слизистой щеки: эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки черепицеобразной формы; ядра с ядрышком.

КЛЕТКИ СЛИЗИСТОЙ ЩЕКИ: ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ
ЩЕКИ ЧЕРЕПИЦЕОБРАЗНОЙ ФОРМЫ; ЯДРА С ЯДРЫШКОМ.