Лабораторная работа № 3. Ферменты

1.

17.09.2026
Лабораторная работа № 3
Ферменты
.
Цель работы – изучение механизма и специфичности действия ферментов, влияние на
процессы катализа ингибиторов и активаторов реакции, условий проведения реакции.
Записать определения следующих терминов: ферменты, энзимология, холофермент,
апофермент, кофактор, кофермент, простетическая группа, активный центр фермента,
аллостерический центр фермента, субстрат, изофермент
2. Зарисуйте схему образования ферментсубстратного комплекса и опишите 4 стадии его
формирования.
3. Зарисуйте две основные модели Фишера и
Кошланда
объясняющих
конформационные
изменения в молекуле при связывании фермента и
субстрата
3. Записать специфические свойства
ферментов (не менее 10).
1

2.

2

3.

Опыт 1. Термолабильность ферментов.
Цель – изучить термолабильность фермента амилазы.
Принцип метода. Исследуется влияние изменения температуры внешней среды на активность фермента
амилазы слюны.
Реактивы и оборудование: разбавленная слюна (1 мл слюны + 10 мл воды); 1% р-р крахмала на 0,3% р-ре
NaCl; реактив Люголя (в 100 мл воды растворяют 20 г иодида калия и 10 г йода. Для реакции с крахмалом
полученный раствор разводят водой 1:5) штатив с пробирками, спиртовка, термостат (37 С); стакан со льдом.
Ход работы. В четыре пробирки наливают по 1 мл разбавленного раствора амилазы слюны. Первую
пробирку кипятят 2 минуты. Затем во все пробирки приливают 10 капель крахмала. Пробирку 2 ставят в термостат
на 10 минут. Пробирку 3 погружают на 10 минут на лед. Пробирку 4 оставляют при комнатной температуре. По
истечении 10 минут во все пробирки добавляют по 1 капле раствора Люголя. Результаты заносят в таблицу 1 и
делают выводы о наблюдаемом цвете в пробирках.
Таблица 1 – Реакция амилазы на крахмал при разных температурах
№ пробирки
1
2
3
4
Состояние
фермента
Условия инкубации
Окраска с йодом
10 мин, 100 С
10 мин, 37 С
10 мин, 0 С
10 мин, 21 С
Описать в каждой пробирке причину окраски.
Ответьте на вопросы:
1. Какова зависимость между температурой и скоростью ферментативных реакций?
2. Приведите примеры использования высоких и низких температур в животноводстве и
ветеринарии.
3. Изобразите графически влияние температуры на скорость реакции с участием
неорганических катализаторов и ферментов. Объясните различие.
3

4.

Опыт 2. Ферментативный гидролиз крахмала.
Цель – приготовить раствор амилазы слюны и осуществить гидролиз крахмала.
Принцип метода. Фермент амилаза относится к классу гидролаз, подклассу гликозидаз
(3.2.1.1). Крахмал под ее действием распадается сначала на продукты с меньшей степенью
полимеризации – декстрины, потом в дисахарид – мальтозу и в итоге в глюкозу. Т.е. получается
набор сахаридов
Реактивы и оборудование: разбавленная слюна (прополоскать рот водой, набрать в рот 25
мл воды, прополоскать 1 мин и собрать все в стакан, профильтровав через фильтр из марли); 1%
р-р крахмала на 0,3% р-р NaCl; реактив Люголя ; штатив с пробирками, термостат (37 С), стакана
на 50 мл.
Ход работы. В 1 пробирку налейте 2 мл крахмала и прилейте каплю раствора Люголя. В
стакан возьмите 10 мл полученного раствора слюны, прибавьте 10 мл раствора крахмала.
Выдержите смесь при 37 С в термостате 10 минут, причем каждые 2 минуты отбирайте по 2 мл
пробы и добавляйте в нее по капле раствора Люголя. Результаты запишите в таблицу 2.
Таблица 2 - Окраска продуктов реакции ферментативного гидролиза крахмала с йодом.
№ пробирки
1 (до внесения фермента)
2
3
4
5
6
Время инкубации, минут
0
2
4
6
8
10
Окраска с йодом
Описать строение и процесс распада молекулы крахмала под действием
фермента. Строение амилозы и амилопектина. Какие продукты распада
4
образуются (декстрины) и как они окрашиваются.

5.

5

6.

Опыт 3. Влияние рН на действие ферментов
Цель – определить влияние рН окружающей среды на активность ферментов.
Принцип метода. Для разных ферментов существует свой оптимальный рН при котором
фермент работает. Большинство ферментов работают при рН 6,0-8,0. Исключения – пепсин
2,0; аргиназа -10,0. Отклонения рН среды от оптимального приводит к ионизации молекулы
фермента и нарушению связи апофермента и кофактора, что приводит к нарушению связи
фермент-субстрат. Оптимум рН для амилазы можно определить при взаимодействии ее с
крахмалом при различных значениях рН среды – при оптимальном рН расщепление крахмала
произойдет полностью и реакции с йодом не будет. Но при удалении в кислую или щелочную
сторону, гидролиз будет происходить не полностью, до образования декстринов, окрашенных
в бурый или красный цвет, или крахмал вообще не будет расщепляться и реакция с йодом
будет положительной.
Реактивы и оборудование: термостат, штатив с пробирками, разбавленная слюна
(прополоскать рот водой, набрать в рот 25 мл воды, прополоскать 1 мин и собрать все в
стакан, профильтровав через фильтр из марли); 0,1 М р-р лимонной кислоты; 0,2 М р-р
Na2HPO4; 1% р-р крахмала на 0,3% р-ре NaCl; раствор Люголя
Ход работы: В семь пробирок наливают 0,1 М раствор лимонной кислоты и 0,2 М р-р
Na2HPO4 в количествах, указанных в таблице, получая буферные смеси объемом 1 мл с
разным значением рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку вносят по 1 мл слюны и 0,5 мл
крахмала. Инкубируют 10 мин при 37 С. Добавляют по капле йода и делаю вывод об
оптимальном рН для работы фермента амилазы.
6

7.

Таблица 3 – Изучение оптимума рН для амилазы
№ пробирки
1
2
3
4
5
6
7
Кол-во 0,2 М
Na2HPO4, мл
0,58
0,63
0,69
0,77
0,87
0,94
0,97
Кол-во 0,1 М
лимонной кислоты, мл
0,42
0,37
0,31
0,23
0,13
0,06
0,03
рН смеси
Окраска с
йодом
5,6
6,0
6,4
6,8
7,2
7,6
8,0
Выводы:
Ответьте на вопросы:
1. Почему амилаза слюны теряет свою активность при попадании в желудок.
2. Где преимущественно осуществляется гидролиз крахмала в организме животного?
7

8.

Опыт 4. Оценка специфичности действия ферментов
Цель – изучить свойство избирательного ферментативного действия на примере амилазы и
сахаразы.
Принцип метода. Ферменты обладают необычайно высокой специфичностью. Начальным
этапом каталитического акта является образование фермент-субстратного комплекса, т. е.
связывание субстрата с каталитическим центром фермента. Пространственная
конформация субстратного центра должна находиться в точном геометрическом
соответствии со структурой молекулы субстрата. Только в этом случае возможно
образование фермент-субстратного комплекса и осуществление каталитической функции
фермента.
Реактивы и оборудование: штатив с пробирками, пипетки, термостат, спиртовка, 1% р-р
крахмала на 0,3% р-ре NaCl; 2% р-р сахарозы; разбавленная слюна; сахараза из дрожжей
(0,5 г сухих дрожжей растирают в ступке, затем гомогенизируют в 5 мл воды,
профильтровать через фильтр); р-р Люголя; реактив Феллинга (Готовят два раствора:
Раствор 1) 3,465 г CuSO4 5H2O растворяют в небольшом объеме воды, потом доводят до 50
мл воды. Раствор 2) 17,3 г сегнетовой соли (натрий-калий-тартрат) растворяют в небольшом
объеме воды в колбе на 50 мл, прибавляют туда 6,25 г NaOH растворенного в 10 мл воды, и
доводят до метки 50 мл водой. Перед употреблением раствор 1 и 2 смешивают в равных
количествах.
Ход работы: В пробирки 1 и 2 наливают по 4 мл раствора крахмала, в пробирки 3 и 4 – по 4
мл раствора сахарозы. В пробирки 1 и 3 добавляют по 2 мл разбавленной слюны (амилаза),
в пробирки 2 и 4 – по 2 мл раствора сахаразы. Содержимое пробирок перемешивают и
инкубируют 10 мин. в термостате (37° С). Затем в пробирки 1 и 2 добавляют по 1 капле
реактива Люголя, в пробирки 3 и 4 – по 1 мл реактива Фелинга и нагревают. Наблюдения
записывают в таблицу 4.
8

9.

Таблица 4. – Действие ферментов амилазы и сахаразы на субстраты.
№ пробирки
Субстрат
Фермент
1
2
3
4
крахмал
крахмал
сахароза
сахароза
амилаза
сахараза
амилаза
сахараза
Окраска с йодом
Окраска с реактивом
Феллинга
Выводы:
Описать подробно, почему в каждой пробирки получился соответствующий
цвет, написать реакцию восстановления глюкозы с реактивом Феллинга,
подписав продукты реакции.
Ответе на вопросы:
1. Какие виды специфичности ферментов бывают?
9

10.

10

11.

Опыт 5. Действие ингибиторов и активаторов на амилазу
Цель – исследуется активность амилазы в присутствии соединений, обладающих активирующими и
ингибирующими действиями на фермент.
Принцип метода. Регуляция деятельности ферментов осуществляется как в клетке, так и вне ее путем
присоединения к молекуле фермента ряда низкомолекулярных веществ. Активаторы, присоединяясь к
молекуле неактивного предшественника фермента, способны изменять ее конформацию с
образованием соединения, обладающего каталитической, активностью. Функцию активаторов часто
выполняют ионы металлов и некоторые анионы. Угнетающее действие ингибиторов реализуется путем
изменения нативной конформации фермента. Ингибиторами могут быть неорганические соли,
метаболиты, гормоны. Место прикрепления эффектора к молекуле фермента называется
аллостерическим центром.
Реактивы и оборудование: разбавленная слюна, 1% крахмал, 1% NaCl, 1% СuSO4, раствор Люголя,
термостат, штатив с пробирками
Ход работы: В две пробирки наливают по 4 мл раствора крахмала, в пробирку 1 добавляют 2 мл
раствора хлорида натрия, а в пробирку 2 – 2 мл раствора сульфата меди. В обе пробирки приливают по
2 мл слюны, содержимое перемешивают и выдерживают 10 мин в термостате. Затем в обе пробирки
добавляют по капле раствора Люголя. Наблюдаемые изменения окраски заносят в таблицу и делают
вывод о влиянии хлорида натрия и сульфата меди на активность амилазы.
Таблица 5 – Действие активаторов и ингибиторов на амилазу слюны
№ пробирки Эффектор
1
2
NaCl
CuSO4
Действие эффектора Субстра Фермент
т
крахмал
амилаза
крахмал
амилаза
Окраска с йодом
Опишите явления в каждой пробирке и сделайте выводы о влиянии эффекторов
на активность амилазы.
11

12.

Работа 6. Определение константы Михаэлиса и максимальной скорости
ферментативной реакции.
Цель исследования – определить по экспериментальным данным скорости реакции
распада глутаминовой кислоты и ее концентрации константу равновесия данной реакции и
максимальную скорость ферментативной реакции используя формулу Михаэлиса-Мэнтон и
график Лайнувера-Бэрка.
Принцип метода. Ферментативная активность зависит в основном от температуры, рН,
концентрации фермента и субстрата, присутствия ингибиторов. Кроме того, ферменты
регулируют как скорость прямой, так и обратной реакции, а значит, существует состояние,
когда скорость прямой реакции, которую катализирует фермент, будет равна скорости
обратной и в системе установится равновесие. Если известны равновесные концентрации
исходных веществ и продукта реакции, то можно по ним найти константу равновесия.
Обычно начальная концентрация субстрата в тысячи раз превышает концентрацию
фермента, и скорость ферментативной реакции будет повышаться до тех пор, пока все
активные центры фермента не будут заняты, после этого скорость реакции уже не будет
возрастать, даже если концентрация субстрата повыситься, т.к. все активные центры будут
заняты. При постоянной концентрации фермента, кривая зависимости скорости
катализируемой им реакции от концентрации субстрата будет иметь форму гиперболическую
форму. Впервые теоретические основы этого процесса были описаны Леонором Михаэлисом
и Мод Ментен и они предложили математическую формулу для описания этого процесса,
выражающую зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата
12

13.

А-низкая концентрация субстрата, С – высокая концентрация субстрата, Вконцентрация субстрата, равная константе Михаэлиса
13

14.

Константа Михаэлиса является мерой сродства фермента к субстрату и она численно равна
концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине
максимальной скорости. Из графика видно, что точки Vmax и Км трудно определить точно.
Поэтому Лайнуивер и Бэрк видоизменили эту формулу, предложив строить график в двойных
обратных координатах, и тогда уравнение Михаэлиса преобразуется
Это уравнение прямой у=kх+b, где у=1/Vо, х=1/[S], k=КМ/Vmax (угловой коэффициент),
b = 1/Vmax (отрезок по оси У).
Ход работы: Фермент глутаматдегидрогеназа катализирует реакцию
14

15.

Скорость реакции измеряли по увеличению экстинкции среды при длине волны 340 нм в единицу времени,
которое происходило вследствие восстановления НАД+. и снижении светопропускания раствора из-за
увеличения концентрации продукта реакции. При измерении скорости данной реакции при различных
концентрациях субстрата и постоянной концентрации НАД+ были получены данные, представленные в
таблице 6. Постройте график зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата и
определите константу Михаэлиса и максимальную скорость ферментативной реакции. Проверьте
полученное значение методом интерполяции и по уравнению Лайнуивера и Бэрка (в программе Excell).
Таблица 6 – Экспериментальные данные зависимости скорости начальной реакции превращения
глутаминовой кислоты от ее концентрации.
Начальная скорость реакции Vo, Е340/мин
Концентрация глутаминовой к-ты S, ммоль/л
0,250
3,33
0,286
5,00
0,303
6,67
0,334
10,00
0,385
20,00
0,385
25,00
0,385
30,00
При построении графика по уравнению Лайнуивера-Бэрка в программе Excell выбираем в типе
диаграммы «Точечный график» и строим его по данным (1/Vo и 1/S). После построения графика нужно
сформировать линию тренда и поставить значок «Показать уравнение линии тренда». Это будет
рассчитанное уравнение у=kх+b Лайнуивера-Бэрка
15