Электронная микроскопия биологических объектов

1.

Электронная микроскопия
биологических объектов
Киреев Игорь Игоревич,
д.б.н.
Зав. отделом электронной микроскопии НИИ ФХБ МГУ
Корпус А, к. 240, 236
Тел. 939-5528
[email protected]

2.

“Лучше один раз увидеть, чем сто раз услышать”
(русская народная пословица)
“Videre est credere” (“Seeing is believing”)
(Латинская пословица)

3.

80% информации об окружающем мире
человек получает при помощи зрения
Радио
Радио
Здание
Микроволны
Человек
Пчела
ИК
Кончик иглы
Видимый
Клетка
УФ
Рентген
гамма
Молекула
Атом
Атомное ядро

4.

Почему электронный микроскоп?
Разрешение оптического микроскопа
d=
0.61  0.61 
≈
nsin 
NA
где – длина волны, n – показатель
преломления среды, – максимальный
угол
Электроны проявляют свойства электромагнитных волн.
≈

h
E
2 m0 E 1

2
2m0 c

5.

Эрнст Руска (Германия)
Нобелевская премия по физике
1986 г. за изобретение
электронного микроскопа

6.

Электронный микроскоп Э.Руски (1933 г.)

7.

Что можно узнать об объекте при
помощи электронного микроскопа?
•Топография – как объект “выглядит” (текстура)
•Морфология – размеры, форма частиц, составляющих
объект
•Состав – химические элементы и вещества в составе
объекта, их относительное содержание
•Кристаллографическая информация – взаимное
расположение атомов в объекте.

8.

Современный электронный микроскоп

9.

Как работает электронный микроскоп?

10.

Источники электронов (электронные пушки)
А. Пушки с термоэлектронной эмиссией
Катод на основе вольфрамовой нити накаливания или кристалла
гексаборида лантана (последний обладает большей яркостью,
меньшей площадью эмиссии и меньший энергетический разброс
электронов).
Б. Пушки с полевой эмиссией (холодной или термополевой)
Катод имеет очень тонкое острие (около 0.1 мкм), на котором из-за
кривизны поверхности возникает сильное электрическое поле,
стимулирующее эмиссию электронов.

11.

Источники электронов (электронные пушки)
резистор смещения
филамент (катод)
электрод Венельта
_
+
анод
заземление
≈

h
E
2 m0 E 1

2
2m0 c
Ускоряющее напряжение
обычно составляет
40-400 кЭв

12.

Электромагнитные линзы
Благодаря заряду, электроны отклоняются от прямолиненой
траектории в электромагнитном поле под действием силы
Лоренца.
e-
windings
windings
soft iron
pole piece
electrons are charged, and are therefore
deflected when they cross a magnetic field

13.

Электромагнитные линзы
Благодаря заряду, электроны отклоняются от прямолиненой
траектории в электромагнитном поле под действием силы
Лоренца.
 =−e  

F
⋅B
e-
N
S

14.

Разрешающая способность микроскопа

15.

Разрешающая способность микроскопа
≈

h
E
2 m0 E 1

2
2m0 c
10кЭв = 12.3 * 10-12 м
200кЭв = 2.5 * 10-12 м
d = 0.65 (Cs 3)1/4 ~ 8 * 10-11 м

16.

Взаимодействие электронов с веществом
Электронный пучок
Отраженные электроны
Рентгеновское излучение
Оже е-
Неупруго рассеяные е-
Катодолюминесценция
Вторичные электроны
Упруго рассеяные е-
Нерассеяные еЭлектроны, преодолевшие образец

17.

Взаимодействие электронов с веществом
Вторичные е- 10 нм
Оже 1-3 нм
Рассеяные е- 1мкм
5 мкм
Глубина проникновения электронов
При ускоряющем напряжении 20 кВ

18.

Взаимодействие электронов с веществом

19.

Зачем электронному микроскопу нужен вакуум?
Исключить рассеяние электронов в результате столновения с
молекулами газа
Исключить образование разряда между катодом и анодом
Исключить повреждение катода
Предотвратить оседание молекул газа на образце под действием
электронного пучка
В стандартных микроскопах поддерживается вакуум 10-4 Ра, для
высоковольтных требуется более высокий вакуум – до 10-7 – 10-9
Ра
Многоступенчатая вакуумная система: ротационные насосы
предварительной откачки и диффузионный насос.

20.

Формирование контраста в электронной микроскопии
1. В режиме светлого поля контраст формируется в
результате поглощения электронов образцом
2. Диффракционный
контраст
в
результате
упорядоченного
рассеяния
электронов
на
кристаллических структурах
3. Спектроскопия потерь
позволяет отфильтровать
энергии
энергий электронов
электроны заданной

21.

Взаимодействие электронов с веществом
Электронный пучок
Отраженные электроны
Рентгеновское излучение
Оже е-
Неупруго рассеяные е-
Катодолюминесценция
Вторичные электроны
Упруго рассеяные е-
Нерассеяные еЭлектроны, преодолевшие образец

22.

(1) при взаимодействии с электронами внутренних оболочек:
а) эти электроны выбиваются (вторичные электроны)
б) падающие высокоэнергичные электроны отражаются
(отраженные электроны)
в) электроны с внешних оболочек перехдят на освободившиеся
внутренние с излучением гамма-квантов характеристической
энергии.

23.

(2) при взаимодействии с ядром атома:
а) отклонение от прямолинейной траектории без потери
скорости (упругое рассеяние)
б) потеря энергии и эмиссия гамма-квантов разной длины
волны.

24.

(3) при взаимодействии с электронами внешних оболочек:
а) выбивание (или внедрение) электронов с образованием
свободных радикалов
б) взаимодействие последних с соседними атомами приводит
к значительным изменениям структуры образца, особенно
легких атомов. Из-за подобного радиационного повреждения
образца наблюдение живых объектов невозможно
в) следует минимизировать время взаимодействия образца с
пучком электронов, увеличить ускоряющее напряжение и
вести наблюдение при низкой температуре (-160oC)

25.

(4) при отсутствии взаимодействия прошедшие через образец
электроны используются для формирования изображения при
помощи
а) люминесцентного экрана
б) фотопленки
в) CCD-камеры

26.

Энергетическая фильтрация электронов
Пик нулевых потерь
Плазмонный резонанс
Потеря энергии (эВ)

27.

Энергетическая фильтрация электронов

28.

Энергетическая фильтрация электронов

29.

Сканирующий электронный микроскоп

30.

Для наблюдения в стандартном сканирующем микроскопе
образцы должны быть электропроводными (по крайней мере
на поверхности) и заземленными. Электропроводность
достигается напылением образцов тонким слоем металла
(золото) или импрегнацией металлами (напр. Os).