Образовательный курс: Regional Capacity-building for Integration of Next Generation Sequencing in the Clinical Microlab

1.

European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
ESCMID Postgraduate Education Course
Участие в образовательном курсе
«Regional Capacity-building for Integration
of Next Generation Sequencing in the
Clinical Microlab»
30/10 – 1/11, 2017 Herzliya, Israel
Руководитель отдела: д.м.н. Т.В. Припутневич.
Докладчик: с.н.с., к.б.н. А.Б. Гордеев.

2.

3.

Участники курса
Нидерланды
Германия
Бельгия
Румыния
Албания
Франция
Италия
Польша
Португалия
Более 100 участников из 18 стран
Швеция
Испания
Австрия
Канада
США
Россия
Индия
ЮАР
Израиль

4.

Лекторы
Alexander Friedrich,
University of Groningen, Нидерланды,
Индекс Хирша (Scopus)-45.
Dag Harmsen,
Universitatsklinikum Münster,
Германия, Индекс Хирша (Scopus)-38.
Eric Claas, Leiden University,
Нидерланды, Индекс Хирша (Scopus)-45.
Paul Savelkoul, Maastricht University, Нидерланды,
Индекс Хирша (Scopus)-39.
Jacob Moran-Gilad, Ben-Gurion University,
Beer Sheva, Израиль,
Индекс Хирша (Scopus)-22.

5. День 1

Alexander Friedrich, Groningen, Нидерланды – Обзор NGS и новых
технологий в медицинской микробиологии.
Eric Claas, Leiden, Нидерланды – Основы NGS I. Обзор платформ и
оборудования для проведения секвенирования.
John Rossen, Groningen, Нидерланды – Основы NGS II. Экстракция
нуклеиновых кислот и приготовления библиотек для проведения
NGS микроорганизмов.
Интерактивное обсуждение. Как реализовать «мокрое» NGS в
лаборатории клинической микробиологии.
Joao Andre Carrico, Lisbon, Португалия – Обзор подходов к
молекулярному типированию бактериальных патогенов.
Jacob Moran-Gilad, Beer Sheva, Израиль – Углубленное NGS I. Как
получить клинически значимую информацию из бактериальных
полногеномных нуклеотидных последовательностей?
Dag Harmsen, Münster, Германия – Углубленное NGS II. Возможности
типирования бактерий с использованием NGS.

6. День 1

Современная лаборатория клинической микробиологии
< 6 часов
Взятие
образцов
< 30 минут
< 12 часов
Лаборатория «мокрой»
биологии (Wet-Lab)
Культуральные
исследования
Интернет-Лаборатория
(E-Lab)
Масс-спектрометрия
NGS/Метагеномика
Современная микробиологическая
лаборатория не может обходиться без
молекулярно-генетических методов
Методы должны быть одним из
инструментов микробиолога
Результат
(< 24 часов)
«Быстрая микробиология»
- результат <24 часов

7. День 1

Секвенирование: история развития метода
Секвенирование нуклеиновых кислот – определение их нуклеотидной
последовательности. Применяется в различных областях биологии и медицины
(генетика человека, клиническая микробиология и т.д.)
1977 г. – появление секвенирования как метода (А.М. Максам и У. Гилберт) – метод
химической деградации меченной ДНК.
1977 г. – метод Сэнгера (секвенирована последовательность фага phiX174 – статья в
Nature) – метод обрыва цепи.
Примерно десять лет назад:
Next Generation Sequencing (секвенирование следующего
поколения, высокопроизводительное секвенирование)
- дешево – быстро - удобно

8. День 1

NGS: основные моменты
Большое разнообразие платформ для секвенирования:
• Ion Torrent: полупроводниковое секвенирование.
• Illumina: секвенирование синтезом. Линейка секвенаторов в зависимости от целей
секвенирования и объемов.
• PacBio: SMRT-секвенирование – линейная амплификация.
• Pacific Biosciences – SMRT-секвенирование отдельными молекулами полимеразы.
• Oxford Nanopore.
Процесс проведения NGS:
Выделение
ДНК/РНК
Приготовление
образцов/библиотек
Биоинформатический анализ
- типирование (SNP)
- резистентность к антимикробным
препаратам
- типирование вирулентности
Секвенирование
Сборка

9. День 1

Типирование микроорганизмов
Популяционная
генетика
бактерий
Патогенез и
эволюция
инфекций
Обнаружение
и контроль
вспышек
Надзор за
инфекционными
заболеваниями
Цель типирования:
Разделение штаммов внутри видов или
подвидов.
Результат: определение подтипа / типа /
клона / линии.
Фенотипические методы:
• рост и морфологические
характеристики
• физиологические характеристики:
тестирование чувствительности к
антибиотикам и тяжелым металлам
серотипирование
Генотипические методы:
экстрахромосомальные методы:
плазмидный фингерпринтинг
хромосомальные:
RFLP / AFLP / RAPD / PFGE
Методы, основанные на
секвенировании:
MLST / MLVA
spa / emm

10. День 2

Colin Mackenzie, Düsseldorf, Германия – Применение NGS для изучения
мультирезистентности энтеробактерий.
John Rossen, Groningen, Нидерланды – Применение NGS для изучения вспышек
госпитальных инфекций.
Paul Savelkoul, Maastricht, Нидерланды – Метагеномика I. Применение NGS для
анализа микробиомов.
Maria Luisa Ricci, Rome, Италия – Метагеномика II. Применение для
исследования водных систем.
Eddie Cytryn, Modiin, Израиль – Метагеномика III. Применение для надзора за
антибиотикорезистентностью в окружающей среде.
Amparo Fernandez Rodriguez, Madrid, Испания – Метагеномика IV. Применение
для микробиологических задач судебной экспертизы.
Jacob Moran-Gilad, Beer Sheva, Израиль – Применение NGS для решения задач
программы «One Health» («Единое здоровье»).
Интерактивное обсуждение. Интерпретация результатов NGS. Точка зрения
клиницистов.
Интерактивное обсуждение. Вопросы качества при реализации новой
технологии в лаборатории клинической микробиологии.

11. День 2

Применение NGS для изучения вспышек госпитальных инфекций
NGS позволяет ответить на вопросы:
1. На сегодняшний момент допустили ли вы колонизацию и
инфицирование?
Типирование для определения генетического сходства (изолят)
Проведение скрининга (клинический образец)
Метагеномика (клинический образец)
2. Есть ли у нас инфекция и какая?
Видовая идентификация по 16S (16-23S) рДНК (клинический образец)
Метагеномика (клинический образец)
3. Какой может быть оптимальная терапия?
Определение генов вирулентности и резистентности (изолят)
Метагеномика (клинический образец)

12. День 2

Применение NGS для изучения вспышек госпитальных инфекций
Молекулярное типирование cgMLST:
- Имеет преимущества перед «классическими» вариантами типирования:
намного выше селективность.
Пример:
Escherichia coli. Во время вспышки госпитальной инфекции выделено 2 изолята.
Цель – установить их родство и показать, являются ли они эпидемиологически
значимыми.
Изолят 1
Изолят 2
СТ-24
ST-117
СТ-71
ST-117
Изолят,
вызвавший
вспышку
СТ-24
ST-117
MLST – 7 генов
cgMLST – 1 423 гена

13. День 3

Joao Andre Caricco, Lisbon, Португалия – Биоинформатика I.
Международные базы данных геномов и генов, контроль качества
бактериальных геномов.
Интерактивное обсуждение. Я секвенировал бактериальный геном –
что дальше?
Joao Andre Caricco, Lisbon, Португалия – Биоинформатика II.
Графическое представление результатов полногеномного (WGS)
анализа.
Ines Steffens, Solna, Швеция – Рекомендации при подготовке публикации
исследований с использованием NGS. Взгляд со стороны редакции
журнала “Eurosurveillance”.
Заключительное обсуждение.

14. День 3

Качество NGS-исследований штаммов микроорганизмов зависит:
1.
От качества выполнения технической части:
правильное приготовление образцов/библиотек
аппаратная база
квалификация персонала
Требования к основным характеристикам: число контигов <
1000, показатель N50 > 15 000, максимальная длина контига >
50 000, покрытие > 30X, процент использованных ридов > 90%.
2. От умения специалистов правильно провести
биоинформатический анализ и правильно интерпретировать
данные. Без знаний о биологии возбудителей невозможно
получить полезные для клиницистов результаты!

15. День 3

Весь NGS на одном слайде
Идеальный
сценарий
Микробиологический
образец
Магическая
коробка
NGS-чудес для
клинической
микробиологии
Полностью охарактеризованный штамм:
• видовая идентификация
• серотип
• сиквенс-тип (MLST)
• cgMLST / wgMLST / SNP’ы
• профиль антибиотикорезистентности
• факторы вирулентности
• другая информация, например,
- spa (S. aureus)
- emm (стрептококки группы А)
Актуальная информация для:
• Диагностики
• Эпидемиологического надзора
• Обнаружения вспышек

16. Применение полученных знаний

В настоящее время мы совместно с отделом клинической и молекулярной
генетики (д.б.н., профессор Д.Ю. Трофимов) развиваем новое направление
– использование NGS для решения следующих задач:
1.Изучение антибиотикорезистентности микроорганизмов.
2.Типирование госпитальных штаммов микроорганизмов.
3.Изучение микробиоты.

17. Место проведения курса

«Герцлия - один из значимых в Израиле центров отдыха и международного туризма. Приморский
район города Герцлия - «посёлок миллионеров». Это самая интересная часть города, которая
считается «Силиконовой долиной» Израиля. Именно здесь вы найдёте чудесный пляж, шикарную
набережную с множеством отелей и ресторанов, элитную частную больницу Герцлия Медикал
Центр, а также это один из самых престижных, комфортабельных и дорогих жилых районов
Израиля.» (Википедия)

18.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !