Эмбриоселекция

1. Лекция 5. Эмбриоселекция

Содержание:
1. Методы вымывания и пересадки эмбрионов…..
2. Эмбриоселекция: понятие и основные
направления…………………………………………

2. 1 Методы вымывания и пересадки эмбрионов

3.

Классификация методов извлечения эмбрионов
После забоя донора
Хирургические – использование техники
хирургической операции для доступа в
полость матки
Нехирургический – доступ к матке через
естественный половой тракт с помощью
специальных инструментов и манипуляций

4.

Хирургические методы
Лапоротомия в области голодной ямки

5.

Хирургические методы
Лапоротомия белой линии живота

6.

Извлечение эмбрионов из
матки
Игла
шприца
Лигатура

7.

Нехирургический метод

8.

Нехирургический метод

9.

10.

Тренажер для обучения
ректальному исследованию

11.

12.

Методы пересадки эмбрионов
Хирургические
Нехирургический

13.

Сравнительный анализ методов вымывания и
пересадки
Хирургический:
• универсальный
• травматизм донора
• требования к квалификации персонала
• низкие потери эмбрионов
Нехирургический:
• применим только на крупных животных
• низкий риск травматизма
• относительная легкость при выполнении
• возможны потери эмбриоонов в ходе
вымывания

14. 2 Эмбриоселекция: понятие и основные направления

15.

Эмбриоселекция – совокупность методов,
направленных на оценку и отбор эмбрионов с
нужными свойствами.
Основные направления эмбриоселекции
Отбор по жизнеспособности (качеству)
эмбриона
Разделение эмбрионов по полу
Диагностика генетических аномалий

16.

1. Методы оценки качества эмбрионов
Индифферентные – не оказывают никакого
влияния на жизнеспособность эмбриона
Относительно индифферентные –
оказывают незначительное влияние на
жизнеспособность эмбриона
Жесткие – оказывают значительное воздействие
на жизнеспособность эмбриона

17.

1.1.Индифферентные (безразличные) методы
Морфологическая оценка качества –
основана на визуальной оценке строения и
состояния всех частей эмбриона, а также на
соответствии стадии развития эмбриона его
возрасту.
проводится при микроскопировании с увеличением 100 – 120 ×
эмбрионы оцениваются по 5-ти балльной шкале:
- отличные – 5 баллов
- хорошие – 4 балла
- удовлетворительные – 3 балла
- условно годные – 2 балла
- непригодные – 1 балл

18.

Оценка качества эмбриона (100×)
Поиск эмбрионов (20×)
с. Верх-Ирмень, 1993 г.
Поиск и оценка эмбрионов проводится в стерильном
боксе при температуре 300.

19.

Отличные эмбрионы (5 баллов)
А
С
- клетки правильной округлой формы, тесно
сцеплены
В друг с другом (компактизация)В
перивителлиновое пространство прозрачное, ZP без
повреждений
А
С

20.

Отличные эмбрионы (5 баллов)

21.

Хорошие эмбрионы (4 балла)
- клетки неодинакового
размера, расположены
несимметрично.

22.

Хорошие эмбрионы (4 балла)

23.

Удовлетвортельные эмбрионы (3 балла)
- единичное разрушение клеток, «частичный
зародыш», включения в перивителлиновом
пространстеве.

24.

Удовлетвортельные эмбрионы (3 балла)

25.

Условно годные эмбрионы (2 балла)
- деформация прозрачной оболочки, частичное
разрушение бластомеров разрушение связи между
ними, фрагментация цитоплазмы.

26.

Условно годные эмбрионы (2 балла)

27.

Непригодные эмбрионы (1 балл)
- значительное повреждение клеток, прозрачной
оболочки, несоответствие строения эмбрионов его
возрасту

28.

Непригодные эмбрионы (1 балл)
Для пересадки используют эмбрионы отличного,
хорошего и удовлетворительного качества (5, 4 и
3 б.). Условно годные эмбрионы подвергаются
культивированию.

29.

1.2. Относительно индифферентные методы
Прижизненное (витальное) окрашивание –
основано на использовании красителей, избирательно
реагирующих с живыми и мертвыми клетками
Метод регистрации биопотенциалов – измерение
напряжения электрического поля эмбриона
Изотопный контроль биохимических процессов –
контроль за изменением радиоактивности среды
при распаде С14-глюкозы в среде с эмрионом на
пируват и лактат

30.

Прижизненное витальное окрашивание
Акридиноранж
1:40 000
Красный цвет - живые
Зеленый цвет - мертвые

31.

Регистрация биопотенциалов
U = 40 – 60 мВ - живые
U = 0 мВ - мертвые

32.

1.3. Жесткие методы
Культивирование – подержание
жизнеспособности эмбриона с целью
выяснения его жизнеспособности
Криоконсервация – замораживание
эмбрионов в жидком азоте (при -1960С) с
целью длительного хранения

33.

Культивирование эмбрионов
В искусственных условиях (in vitro) –
проводится в специальных газопроточных
термостатах при температуре 370С и в
газовой среде из 90% СО2, 5%О2 и 5%N2

34.

Культивирование эмбрионов
В промежуточных реципиентах (in vivo)
Время культивирования составляет 24 – 48 ч.
После культивирования эмбрионы вновь
подвергают морфологической оценке
качества.
Пригодными считаются эмбрионы, оцененные
на 5, 4 и 3 балла.
Гелевый цилиндр
Промежуточный реципиент

35.

Криоконсервация эмбрионов - вынужденный метод
оценки качества. Процедуру замораживания и
оттаивания могут выдержать только жизнеспособные
эмбрионы.
Для криоконсервации отбираются эмбрионы только
отличного и хорошего качества.

36.

2. Методы определения пола эмбрионов
Цитогенетический – оценка кариотипа
(хромосомного набора) по половым хромосомам в
ядрах клеток эмбриона
Иммунологический – выявление Н-Yантигена, синтезирующегося в клетках мужских
эмбрионов
Молекулярно-генетический – определение
последовательностей ДНК, маркирующих пол

37. Цитогенетический метод

1. Микробиопсия клеток эмбриона
Кювета для культивирования

38.

2. Культивирование клеток эмбриона
3. Остановка деления клеток колхицином на
стадии метафазы (хромосомы спирализуются и
укорачиваются)
Колхицин

39.

3. Приготовление хромосомных препаратов
Гипотонический раствор цитрата натрия (1%)
Фиксация: метиловый спирт + ледяная уксусная кислота
Окраска препаратов
Предметное стекло

40. 5. Микроскопия хромосомных препаратов

41.

Цитогенетический анализ:
• определение пола;
• выявление хромосомных мутаций (трисомия, моносомия);
• выявление геномных мутаций (полиплоидия, анеуплоидия);
• оценка хромосомной нестабильности (разрывы хромосом).

42.

FISH-метод (fluorescent in-situ hybridization)
идентификации половых хромосом – выявление
локализации хромосом с помощью фрагмента ДНК с
флуоресцентной меткой, гомологичного участку
искомой хромосомы.

43. Иммунологический метод

На поверхности клеток эмбрионов мужского
пола синтезируются специфический белок (НY-антиген), ген которого находится в Yхромосоме.
Антитела
Для выявления антигена в среду с эмбрионами
добавляют флуоресцирующие антитела к Н-Yантигену.

44. Молекулярно-генетические методы

У человека ген амелогенина (AMG) – белка,
образующего структурный матрикс зубной эмали,
локализован в половых хромосомах Х и Y.
Аллель AMGX, расположенный в Х-хромосоме, на 6
Амелогенин – белок,
нуклеотидов короче, в результате делеции
первого
образующий структурный
интрона гена.
матрикс зубной эмали
При идентификации пола, определяются фрагменты
обоих аллелей длиной, соответственно, 112 (АМGY)
и 106 (AMGX ) пар нуклеотидов.

45. Различия в аллелях гена амелогенина человека

Aллель AMGX – 106 п.н.
Aллель AMGY – 112 п.н.
Х-хромосома
Y-хромосома

46. Технология определения пола

Выделение ДНК
Микробиопсия
1
2
3
4
112
106
Электрофорез фрагментов ДНК
половых хромосом
♂
♀
♀
♂

47.

♂
Аллель
AMG Y
♂
Олень
Овца
Олень
♂
♂
♀
♀
♀
Аллель
AMG X

48.

Диагностика генетических аномалий
(преимплантационная генетическая диагностика) –
комплекс методов, направленных на выявление
эмбрионов с генетическими нарушениями с целью
предотвращения рождения неполноценных (больных)
особей.
Цитогенетические методы
Молекулярно-генетичекие методы

49.

Конец