Серологические маркеры парентеральных вирусных гепатитов: диагностическая значимость и интерпретация результатов

1. Серологические маркеры парентеральных вирусных гепатитов: диагностическая значимость и интерпретация результатов.

www.npods.ru

2.

Динамика заболеваемости острым гепатитом В, хроническим
гепатитом В и носительства гепатита В, на 100 000 населения *)
www.npods.ru

3.

Диагностика оккультного
гепатита В и выявление
мутантных форм HВsAg
ООО «НПО «Диагностические системы», 2017г
www.npods.ru

4.

Латентная HBV инфекция
Низкий уровень
репликации HBV,
сниженный синтез и
экспрессия
вирусных антигенов.
Адекватный ответ
иммунной системы,
ингибирующее
воздействии других
вирусов
(HCV, HDV, HIV)
Репликация вируса
не подавлена,
но не выявляется
современными тестсистемами
вследствие мутаций,
изменяющих
структуру его
основных детерминант
Occult hepatitis B
virus infection
www.npods.ru

5. Клинический случай № 1

Пациент, мужчина, 20 лет, не злоупотребляющий алкоголем. Поступил в стационар с признаками асцита.
Результаты обследования:
Билирубин - 41 моль/л, АлАТ – 131 МЕ/л, АсАТ- 194 МЕ/л, щел. фосфатаза - 125 МЕ/л, сывороточный альбумин - 20 г/л,
протромбиновое время - 12.5 с. (кон-ль:10с.), сывороточно-асцитический градиент альбумина-3 г/л, АФП – 50,4 нг/мл.
HBsAg – отриц.
Анти-НСV – отриц.
антиHBs – отриц.
антиHBcor M,G – отриц.
УЗИ брюшной полости показало: эхоструктура паренхимы печени грубая (неравномерно повышенная эхогенность). При
эндоскопии верхнего отдела ЖКТ никаких 4изменений выявлено не было.
С помощью ПЦР выявлена ВГВ-ДНК 8×10 копий/мл.
Окончательный диагноз: цирроз печени.
Клинический случай № 2
Пациент, мужчина, 19 л., не злоупотребляющий алкоголем. Поступил в стационар с синдромом желтухи. При
обследовании обнаружили гепатоспленомегалию.
Анализ крови:
гемоглобин: 14 г/дл, лейкоциты: 7000, общий холестерол – 180 мг/дл, LDL – 125 мг/дл, триглицерид – 45 мг/дл и
HDL=40 мг/дл. Билирубин – 82 ммоль/л, АлАТ – 71 МЕ/л, АсАТ – 64 МЕ/л, щел. фосфатаза – 185 МЕ/л,
сывороточный альбумин – 35 г/л протромбиновое время – 16 c. (control: 12 sec.). АФП – 15,8 нг/мл.
HBsAg – отриц.
Анти-HCV – отриц.
Анти-HBc – отриц.
Анти-HBs – положит.
Проведенная биопсия позволила диагностировать фиброз печени.
7
С помощью ПЦР выявлена ВГВ-ДНК 4×10 копий/мл.
Окончательный
диагноз: цирроз
печени
гипертензией.
Al-Mahtab
M., Khan
M.,с портальной
Rahman S.
Department of Hepatology, Bangabandhu
www.npods.ru
Sheikh Mujib Medical University, Dhaka, Bangladesh

6.

Проблема латентной (оккультной) HBV инфекции
0.1%–2.4% среди доноров крови в странах Европы и США.
(Hollinger, F.B.; Hepatitis, B. Virus infection and transfusion medicine: Science and the occult. Transfusion 2008, 48, 1001–1026.)
7.5%–16% в общей популяции в странах Юго-Восточной Азии.
(Fang, Y.; Shang, Q.L.; Liu, J.Y.; Li, D.; Xu, W.Z.; Teng, X.; Zhao, H.W.; Fu, L.J.; Zhang, F.M.; Gu, H.X. Prevalence of occult hepatitis B virus
infection among hepatopathy patients and healthy people in China. J. Infect. 2009, 58, 383–388).
Данные о распространенности оккультной HBV инфекции варьируют в
зависимости от региона, специфичности и чувствительности рутинных
серологических и NAT тестов
www.npods.ru

7.

Динамика маркеров гепатита В при
остром и хроническом течении инфекции
Время
4-12
нед
1-2
нед
2 нед – 3 мес
HBsAg
+
+
+
+
3 – 6 мес
+
Годы
Anti-HBc IgG
Anti-HBc IgM
HBeAg
Anti-HBe
0.01ME/ml
+
+
Выздоровление
+
+
+
Перелом
заболевания
Окна
Активация
сероконверсии
+
+
+
+
Начало
Выздоровления
+
+
+
+
Разгар
+
+
Начало
разгара
+
Окончание
инкубации
Начало
разгара
HBsAg
Anti-HBc IgM
Anti-HBc
Anti-HBe
Anti-HBs
Инкубация
Маркеры
HBeAg
Anti-HBs

8.

Оккультный гепатит
идентифицируется
не инвазивными и
рутинными тестами,
но результаты часто
игнорируются
Явная
инфекция
?
Только
антиHBcore +
www.npods.ru
Вторичный
оккультный
гепатит В
Анти-HBc +,
ДНК-HBV +
Оккультная
инфекция
Первичный
оккультный
гепатит В
АнтиНBc+,
HBsAg +
Оккультная
инфекция не
идентифицируется
рутинными
тестами
ДНК-HBV +

9.

Проблема латентной (оккультной) HBV инфекции
2004 г. HBV ДНК “+” HBsAg “-” с/без антиHBs[1]
2006 г. HBV ДНК (ткани печени) “+”, HBV ДНК (кровь) “-”, HBsAg “-” [2]
2008 г. Присутствие HBV ДНК в ткани печени (в некоторых случаях в
сыворотке крови) в низкой концентрации ≤ 200 МЕ/мл, HBsAg “-”.
Два варианта оккультного ГВ:
серопозитивный (HBcorAb ± HBsAb)
серонегативный (Ab не выявляются).
«Ложно» оккультный ГВ: Репликация вируса не подавлена
(HBV ДНК > 200 МЕ/мл), но не выявляется современными тест-системами
вследствие мутаций в пpe-S/S гене, кодирующем белки вирусной оболочки в
т.ч. HBsAg. [3]
[1] Allain JP, Transfus Clin Biol, 2004 Feb; 11(1):18-25, [2] Carreno V., World J Gastroenterol,2006, [3] Statements from the Taormina expert meeting on
occult hepatitis B virus infection., European Association for the Study of the Liver. Published by Elsevier B.V.
www.npods.ru

10.

Схема строения вируса
M 133 T
Т 118 R
St 116 ns
www.npods.ru

11.

Соответствие нейтрализующих
антител к HBsAg дикого
и мутантного типа

12.

«Мутантные формы вируса гепатита B могут возникать у
пациентов под воздействием иммунного ответа или лечения.
Мутантные формы, которые возникают в
иммунодоминантных эпитопах HBsAg, позволяют вирусу
размножаться при наличии нейтрализующего иммунного
ответа.
В некоторых тест-системах мутантные формы HBsAg
определяются как ложно-негативные. Изучение
реактивности тест-систем с мутантными формами вируса
гепатита B – ключ к установлению правильного алгоритма
тестирования на вирус гепатита B»
Paul F. Coleman*
*Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA
По материалам CDC (Центра по контролю и профилактике заболеваний, г.
Атланта, США).
www.npods.ru

13. «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ HBsAg С ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ к HBsAg, равной 0,01

«ДС-ИФА-HBsAg-0,01»
ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТСИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
HBsAg С ПОВЫШЕННОЙ
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ к HBsAg,
равной 0,01 МЕ/мл
www.npods.ru
13

14.

Международные требования, предъявляемые к
тестам для выявления HBsAg
Выявление
мутантных форм
HBsAg
Аналитическая
чувствительность
по Второму
Международному
Стандарту HBsAg,
subtype adw2,
genotype A, NIBSC
code: 00/588
Диагностическая
чувствительность
Специфичность
www.npods.ru
EC (Common
Technical
Specification (CTS)
(2011/869/EU)
ВОЗ
Paul-Ehrlich-lnstitut,
Германия
основные мутантные
формы HBsAg
основные мутантные
формы HBsAg
все известные
мутантные формы
HBsAg
не более 0,130 МЕ/мл
не более 0,130 МЕ/мл
< 0.1 МЕ/мл
не менее чем 400
образцов + 30
сероконверсионных
панелях
99.6%
не менее чем 400
образцов + 30
сероконверсионных
панелях
≥98%
не менее чем 400
образцов + 30
сероконверсионных
панелях
99,6%

15.

Минимальные требования CTS (Common Technical Specification – Общие технические
условия), и количество образцов, на которых была аттестована система ДС-ИФА-HBsAg-0,01
www.npods.ru

16.

Prüflabor für In-vitro Diagnostika
beim Paul-Ehrlich-Institut (PEI-IVD)
Paul-Ehrlich-Straße 51-59
Results
D-63225 Langen Sensitivity
Seroconversion
To assess early seroconversion sensitivity of the DS-EIAHBsAg-0,01 and for completion of
the
CTS study, 31 commercial seroconversion panels were investigated. The results of the
individual
panels are given in Appendix 1 Table 6 Part A and Part B.
Results were compared to data available at PEI of further state of the art CE-marked HBsAg
assays listed in Table 3. The DS-EIA-HBsAg-0,01 detected 8 panels (PHM 914, PHM 927,
PHM
928, PHM 934, 6272, 6273, 6274 and 11011) reactive in the same bleed as the most
sensitive
assay from Table 3. Ten panels (PHM 925, PHM 926, PHM 929, PHM 931, PHM 933, 6275,
11000, 11009, 11012 and 11016) were detected one bleed earlier, 11 panels (PHM 916, PHM
930, 6271, 6279, 11001, 11002, 11003, 11006, 11007, 11008, 11017) two bleeds earlier and
two panels (PHM 919 and PHM 932) even three bleeds earlier than any other HBsAg assay
for
which comparative data was available. Comparative results are summarized in Table 4. In
Table
4 assays 1-21 are ranked according to their sensitivity. For each panel the DS-EIA-HBsAg0,01 results are compared the earliest detection by any of the assays.
Taken together the results demonstrate that the DS-EIA-HBsAg-0,01 is by far the most
sensitive
HBsAg test investigated at the Paul-Ehrlich-Institut (Fig. 1). On average the DS-EIAHBsAg0,01 detected HBsAg 1.35 bleeds (or 5.0 days) earlier than the most sensitive assay and
onaverage 3.32 bleeds (or 14.1 days) earlier than the least sensitive assay.
Evaluation Report for DS-EIA-HBsAg-0,01
Manufacturer:
Diagnostic Systems Ltd.
Таким образом, «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» - наиболее
22 Yablonevaya
чувствительный тест,
который
603093
Nizhniyкогда-либо
Novgorod
тестировался в институте
Пауля-Эрлиха.
В
Russian
Federation
среднем, «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» определял HBsAg
на 5 дней раньше, чем самый чувствительный тест
Dr. раньше,
Heinrich Scheiblauer
и, в целом на 14 дней
чем наименее
Phone: +49 6103 777018
чувствительный.
www.npods.ru
Fax: +49 6103 771234
E-mail: schhe @pei.de

17.

Анализ шести сероконверсионных панелей в DS-EIA-HBsAg-0,01
For six seroconversion panels DS‐EIA‐HBsAg‐0.01 assay detected HBsAg
показал, что данный тест обнаруживал
seroconversion onHBsAg
average в среднем 1,3 образца
1.3 specimens earlier than the benchmark assay (Monolisa Ag HBs Plus [Bio‐Rad
раньше, чем эталонный тест (Monolisa
AgFor
HBs Plus [Bio-Rad
Laboratories]).
the lowПри
titer panel,
DS‐EIA‐HBsAg‐0.01
classified
all specimens.
Laboratories]).
анализе
панельных correctly
образцов
с низкими
титрами
For the WHO International Biological Reference Preparation for Hepatitis B surface
HBsAg, В «DS-EIA-HBsAg-0,01» antigen
были [NIBS
правильно классифицированы
code 5086/08], DS‐EIA‐HBsAg‐0.01 detected the 0.13IU/mL. Hepanostika HBsAg
все образцы.
ULTRA also detected
to 0.13
IU/ml.
В Международном биологическом
эталонном
препарате для
поверхностного антигена вируса гепатита В [NIBS code 5086/08], DS-
EIA-HBsAg-0,01 обнаружил 0,13 МЕ/мл., тест Hepanostika HBsAg
www.npods.ruтакже обнаружил 0,13 МЕ/мл.
ULTRA

18.

Согласно требованиям ведущих международных организаций,
работающих в области здравоохранения (ВОЗ, PEI), оценка
чувствительности тестов, применяемых для скрининга донорской крови,
должна оцениваться в первую очередь с применением
- Сероконверсионных панелей
- Панелей нативных образцов, полученных от пациентов, содержащих
различные мутантные формы HBsAg
www.npods.ru

19.

НВsAg native mutants in CDP Plasma (Trina Code: DH1200)
www.npods.ru

20.

www.npods.ru

21.

ДС-ИФА-HBsAg-0,01
Единственная Российская
тест-система
сетифицированная по EC,
рекомендованная ВОЗ и
институтом Пауля-Эрлиха
для диагностики вирусного
гепатита В и скрининга
донорской крови
www.npods.ru

22.

Скрининг на анти-HBc: делать или не
делать?
Аргументы «за»:
• Период “core window” – второе
серологическое окно
• Давняя HBV инфекция после
проведенной терапии и элиминация
анти-HBs
• Хроническая HBV инфекция с низкой
вирусной нагрузкой
• Заражение мутантными штаммами
вируса гепатита В
• Совместное инфицирование HBV/ HIV и
HCV.
Аргументы «против»:
Большее количество
неспецифических реакции
по сравнению с тестами на
другие маркеры
Как интерпретировать?
Известны случаи передачи HBV инфекции от “anti-HBcore alone”
матери к ребенку и от “anti-HBcore alone донора к реципиенту!
www.npods.ru

23.

НАСКОЛЬКО АКТУАЛЬНА ДИАГНОСТИКА анти-HBc?
1. Канада, Иран
2. Индия
www.npods.ru

24.

«…Частота выявления только анти-HBc напрямую
связана с распространенностью ВГB-инфекции.
К примеру, среди доноров в районах с низкой
распространенностью инфекции эта цифра
составляет от 0,4 до 1,7%, а в эндемичных районах
отдельные (изолированные) анти-HBc встречаются в
10-20% случаев. Эта цифра также будет высокой
среди определенных групп населения (лиц с
хронических Гепатитом C, ВИЧ-инфекцией и
употребляющих инъекционные наркотики) даже не в
эндемичных регионах.»
(на основе 13 источников). Интерпретация изолированных антител к
core-антигену ВГB
(Jeanne Marrazzo, MD, MPHChia C. Wang, MD, MS).
Вашингтонский университет, 2006
www.npods.ru

25.

Скрининг на анти-HBc
Скрининг обязателен:
• США
• Япония
• Франция
• Страны Латинской Америки (Бразилия,
Уругвай, Колумбия)
• Отдельные регионы России
www.npods.ru

26. Скрининг на анти-HBc

www.npods.ru

27.

Диагностика Вирусного Гепатита
С с помощью тест-системы для
одновременного определения
Антигена и Антител к HCV
ООО НПО Диагностические Системы
www.npods.ru

28.

Динамика заболеваемости острым гепатитом С, хроническим
гепатитом С, на 100 000 населения *)
www.npods.ru

29.

Вирус Гепатита С
• HCV,
одноцепочечный
РНК
вирус
принадлежащий семейству Flaviviridae
• Определно 6 главных генотипов (1-6) и
несколько субтипов вируса
• Генотипы 1-3 встречаются повсеместно
• Генотипы
4
и
5
встречаются
преимущественно в Африке
• Генотип 6 встречается в Азии
www.npods.ru
Immunology and Cell Biology: “Host and viral factors in
the immunopathogenesis of primary hepatitis C virus
infection”, Andrew R Lloyd,A, et al.

30. Вирус Гепатита С

• Введение тестирования с
использованием технологий по
определению нуклеиновых кислот (NAT)
позволяет и дальше уменьшать период
окна
• ПЦР тесты не являются скрининговыми
для доноров в силу ряда ограничений их
использования
www.npods.ru

31.

Тесты для диагностики Гепатита С
ИФА
Доступная цена
Высокая чувствительность
Простота постановки
Ложно-позитивные результаты
Аутоиммунные процессы
Ложно-негативные
Период «окна»
Хроническая иммуносупрессия
(пациенты после трансплантации
органов, с хронической почечной
недостаточностью на диализе, ВИЧпозитиивные) (Patel et al., 2006)
NAT
Высокая чувствительность
Практически нет периода «окна»
Прямая детекция патогена
Материально-техническое
обеспечение (длительность проведения
анализа,
необходимость дополнительного
оборудования,
высокая квалификация персонала)
Низкое соотношение цены теста к
результату.
Ложно-негативные результаты
Низкая вирусная нагрузка
Мутации в праймерах и в областях
связывания праймера с пробой (Seifried et
al., 2011)
www.npods.ru

32. Тесты для диагностики Гепатита С

ДС-ИФА-HCV-АГАТ
• 2010 – Компания ООО НПО Диагностические системы подписала
соглашение о совместной работы с Центром по контроля и
предотвращению заболеваний (США, Атланта) CRADA Reference
NCHHSTP-08-327-00 по разработке теста для одновременного
определения в крови антигена и антитела вируса гепатита С
• 2011 – набор ДС-ИФА-HCV-АГАТ зарегистрирован в МЗ России
www.npods.ru

33. ДС-ИФА-HCV-АГАТ

Динамика маркеров ВГС
Ат
Свободный
кор-Аг
РНК
0
www.npods.ru
1
2
3
месяцы
4
5
6
17
28
годы
3 9
4 10

34. Динамика маркеров ВГС

РНК
Реактивность Комбо-тестов в сероконверсионных
панелях Zeptometrix 10029, 10023, 10020, 10008 –
негативных на анти-ВГС
РНК
РНК
РНК
ДС-ИФА-ВГС-АгАт (ОД/СО)
HCV Ag/Ab Combo Abbott-Murex (OD/CO)
www.npods.ru

35.

Корреляция вирусной нагрузки и
ОП/ОПкрит в «ДС-ИФА-HCV-АГАТ»
в период серологического окна
Для 6 сероконверсионных панелей
(9041, 9044, 9045, 9047, 6213, 10062)
www.npods.ru
Для сероконверсионной панели 6222

36.

ДС-ИФА-HCV-АГАТ
Формат теста:
– 50 мкл конъюгата 1 (анти-кор Маб
меченые биотином) + 50 мкл
образца
– 30 мин 37°C, шейкер
– 100 мкл конъюгата 2 (стрептавидинПх + анти-Human-IgG-Пх)
– 30 мин 37°C, шейкер
– 100 мкл ТМБ
20 мин КT
Общее время анализа 1 ч 20 мин
www.npods.ru

37. ДС-ИФА-HCV-АГАТ

УТВЕРЖДЕНЫ
постановлением Правительства
Российской Федерации
от 31 декабря 2010 г. № 1230
Правила и методы исследований и правила отбора образцов донорской крови,
необходимые для применения и исполнения технического регламента о требованиях
безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических
средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии
11. При определении маркеров вирусов иммунодефицита
человека, гепатитов В и С и возбудителя сифилиса
необходимо соблюдать следующие правила:
…
Допускается проведение исследования с целью
одновременного определения наличия антител к вирусу
гепатита С и антигена вируса гепатита С;
www.npods.ru

38.

ДС-ИФА-HCV-АГ
Суммарное время инкубации
– 1час 15 мин (шейкер),
Срок годности – 13 месяцев
www.npods.ru
39

39.

Общая цель Плана
действий – к 2030 г.
добиться элиминации
вирусных
гепатитов как угрозы
общественному здоровью
в Европейском регионе
путем
снижения заболеваемости
и смертности
www.npods.ru

40.

СПАСИБО ЗА
ВНИМАНИЕ!
WWW. CDC.GOV
WWW. NPODS. RU
41
www.npods.ru