Биотехнология растений. Разнообразие патогенов. Принципы клеточной селекции

1.

Биотехнология растений

2.

Мучнистая роса
Разнообразие патогенов
Крапчатый вилт
Антракноз
Корневая нематода
Бактериальная сыпь
Вирус мозаики томата
Fusarium вилт
Корончатый галл

3.

Принципы клеточной селекции
Мутагенез (радиоционный, химический)
Исходный эксплант
.
Отбор на уровне
клеток
Культура
Суспензионная
протопластов
культура
Каллусная
культура
.
Отбор мутантов
.
Регенерация
растения
Мутантное растение
.
.
Ретестирование
in vitro
Отбор на
уровне
целых
растений
Генетический анализ Тестирование нового
(R , R )

4.

Мутагенез in vitro
Основные мутагены, используемые в клеточной селекции и некоторые
аспекты их применения
Химические
Физические
1. Этилметансульфонат (ЭМС)
1. γ-излучение. Используется для
получения ауксотрофов, мутантов
2. N-метил-N-нитро-Nустойчивости к гербицидам и
нитрозогуанидин (НГ).
валину
Применяется для получения
2. УФ-излучение. Хорошо
мутантов устойчивости к
аналогам аминокислот, к аналогам зарекомендовала себя при
получении некоторых ауксотрофов
нуклеиновых кислот; для
получения некоторых ауксотрофов и мутантов устойчивости к
валину
3. N-этил-N-нитрозомочевина
3. Рентгеновское излучение.
(НЭМ). Используется для
Применяется для получения
получения мутантов
пигменто-дефектных мутантов
устойчивости к хлорату, аналогам
аминокислот; для получения
мутантов, дефектных по
нитроредуктазе

5.

Получение протопластов
или
проросто
к
лист
Плазматическая
мембрана
протопласт
ы
Обломки клеточных
стенок
Клеточная
стенкацитоплазма
Раствор, содержащий
вакуоль
целлюлазу, сахар и
ядро
соли
Колония
Фильтровальная протопластов
бумага
Питательная
среда
Растение-регенерант
побегообразование
Клетки-няньки
впаены в среду
Среда с высоким
содержанием
цитокининов и низким ауксинов
Среда без цитокининов и низким
содержанием ауксинов

6.

Примеры позитивной клеточной селекции
1а.Устойчивость к селективному агенту на уровне:
Устойчивость на уровне
растения
Трансгенные
растения
Устойчивость на клеточном
уровне
wt
MS0
MS0 MS0+Km
MS0+Km
Nicotiana tabacum
MS0+нистатин (сублетальная
концентрация)
Протопласты картофеля

7.

1б.Устойчивость к полиеновым антибиотикам
A. Каллусы табака на среде не содержащей селективный агент;
Б. Каллусы табака на среде, содержащей летальную концентрацию
нистатина;
B. Каллусы табака на среде содержащей сублетальную
концентрацию нистатина.

8.

Устойчивость к аминокислотам и их аналогам
Биосинтез аминокислот, производных аспартата
Аспартат
AK
Β-аспартилфосфат
Аспарагиновый βполуальдегид
Гомосерин
Треонин
Изолейцин
Метионин
DHDPS
2,3-дигидропиколинат
Лизин
AK - аспартаткиназа;
DHDPS - синтаза дигидропиколиновой кислоты

9.

Гидрофильный слой
Гидрофобный слой
Основные
стерины
Холестерол
Кампестерол
Ситостерол
Стигмастерол
Фосфотидилэтаноламин
Фосфотидилхолин
Расположение в
мембране
Холестерол

10.

Вещества, изменяющие состав стеринов
Нистатин
O
CH3
O
OH
CH3
OH
CH3
O
OH
OH
OH
OH
COOH
O
OH
O
CH3
OH
OH
Полиеновый антибиотик
Образует комплексы со стеролами в
клеточной мембране; приводит к
изменению проницаемости мембраны и
возможной гибели клетки
NH2
OH
Фунгицид
Состав: 25% тридименола
3% фуберидазола
Ингибиторцитохром P-450-зависимой
монооксигеназы, которая удаляет С-14α
метильную группу в процессе стерольного
биосинтеза; приводит к накоплению С14α метилстеролов
OH
Cl
O
CH
CH
OH
CH3
O
CH3
OH
OH OH OH
O
OH
CH3
Филлипин
OH
N
Полиеновый антибиотик
Состав: филлипин III
Байтан
смесь 4х макролидов
OH Связывает стерины с образованием
крупных плоских агрегатов между
бислоями, что приводит к разрушению
мембраны; комплексфиллипин-стерин
локализуется в верхнем билипидном слое
и вызывает деформацию мембраны
C
CH3
N
N
OH
CH3
CH3

11.

Получение растений с измененным
содержанием стеринов
Спектр
растения
дикого типа
Спектр 13/5
растения
Процесс регенерации
Спектры основных стеролов:
Растение-регенерант (табак)
1. Холестерол, 2. Кампестерол,
3. Стигмастерол, 4. Ситостерол,
5. 24-метилен циклоартенол,
6. Циклоартенол, 7. D7-кампестерол,
8. D7-ситостерол, D7-авенастерол,
10. 24-этилдиен лофенол

12.

Модель табак- дрозофила
Растение
Каллус
Диаграмма фертильности Drosophilla на среде содержащей гомогенат
нистатин -устойчивых растений табака

13.

Модель табак- дрозофила
Развитие яичников Drosophilla в норме (слева) и при стерольной диете
(справа)

14.

Модель картофель - фитофтора
Устойчивые к P. infestans растения картофеля линии Rf18
Биотест in vitro:
2-5 растения с различным уровнем
чувствительности
Устойчивые
растения
Биотест in vivo
Контроль

15.

Фенотип “dwarf” растений картофеля, устойчивых к
филлипину
Цветки Rb3 растения (в
середине) и цветки растения
дикого типа (по бокам)
“Dwarf” растение картофеля
линии Rb3 (слева) и растение
дикого типа (справа)

16.

Негативная клеточная селекция

17.

Частота возникновения ауксотрофных клонов у N.
plumbaginifolia
Доза, *
гр
13
Число (частота)
Выживаемость, **
%
тестируемых ауксотрофов
клонов
57
3727
0
16
23
3705
0
19
15
2377
0
23
11
4420
3(8•10-3)
* γ-лучи (60Со-пушка, 0,042 гр/с)
** эффективность высева необлученных протопластов 70%

18. Соматическая гибридизация

19.

Соматическая гибридизация – способ
получения соматических гибридов в
результате слияния протопластов разных
видов ( ФОРМ).

20. Техника получения соматических гибридов.

1.Изоляция протопластов
2. Слияние протопластв различных форм.
3. Идентификация и селекция соматических гибридных клеток.
4.Культивирование гибридных клеток.
5. Регенерация гибридных растений

21.

Методы изоляции протопластов из растительных тканей.)
1. Механический метод
2. Энзиматичекий метод

22. 1. Механический метод

Ткани растений
Надрезы клеточной стенки
Плазмолиз
Выход протопластов
Отбор протопластов

23. 1. Ограничения метода

Можно использовать только
вакуолизированные клетки.
Низкий выход протопластов.
Низкая жизнеспособность протопластов.

24. Энзиматический метод

стерилизация листа,надрезы листовой пластинкиs
Растворы ферментов
Pectinase +cellulase
Pectinase
высвобождение протопластов
изолированные протопласты

25. Энзиматический метод

используют для различных тканей
растений
мезофильные ткани используются
наиболее часто
высокий выход протопластов
протопласты
характеризуются
высокой жизнеспособностью

26.

Слияние протопластов
1.спонтанное слияние
2. индуцированное слияние
химическое
слияние
механическое
слияние
электрослияние

27. спонтанное слияние

протопласты сливаются в процессе
изоляции и их физического контакта

28. индуцированное слияние

химическое
слияние
химическими соединениями
индуцируется
типы химических соединений
PEG
NaNo3
Ca 2+ ions
Polyvinyl alcohal

29. индуцированное слияние

механическое слияние (физическое
слияние)
–используют
инвертированный
микроскоп,микроманипулятор
и
микропипетки
электрослияниеслияние,индуцируемое электрическим
током

30. Идентификация и селекция соматических гибридов

идентификация гибридов основана на
различиях между родительскими и
гибридными клетками
• пигментация
• цитоплазматические
маркеры
(наличиеотсутствие хлоропластов)
• использование ауксотрофных мутантов
• .физиологические различия родительских
клеток

31.

32.

Identification of the somatic hybrids using RAPD analysis
1 2
M
h h h h h

33.

селекция гибридных клеток
(используемые маркеры )
• генетическая комплементация
• гормонезависимость по гормонам
• ауксотрофные мутанты и мутанты по
метаболизму
• анализ хромосом

34. использование соматических гибридов

получение новых межвидовых гибридов
Pomato (гибрид картофеля и томата)
получение
фертильных
диплоидов
и
полиплоидов
от
стерильных
гаплоидов,триплоидов и анеуплоидов
перенос
генов
интереса,например,
устойчивости от дикорастущих форм к
культурным

35.

изучение генов цитоплазматических
детерминант
анализ групп сцепления хлоропластов и
митохондрий
получение уникальных гибридов с
разным сочетанием ядерных генов и
генов цитоплазматических детерминант

36.

37.

38.

39.

PVY-infected potato plants ( ) and resistant ( )
field growing somatic hybrids
Solanum tuberosum (+) Solanum etuberosum

40.

41.

Genome composition of the BC2 hybrid (AAAE)
determined by using GISH analysis
4х=(39 potato chromosomes) and (12 S.etuberosum chromosomes)
BC2 hybrid derived from the sexual crosses of potato and
interspecific somatic hybrid
Solanum tuberosum (genome A) (+) S.etuberosum (genome E)