Типы_Полимеразной_цепной_реакции

1.

МЕТОДЫ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ
ЦЕПНОЙ
РЕАКЦИИ

2.

ТИПЫ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ
ЦЕПНОЙ
РЕАКЦИИ

3.

3
ПЦР С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ
Рисунок 1. Схема ОТ-ПЦР.
К одноцепочечной РНК-матрице присоединяется праймер, и обратная транскриптаза
синтезирует цепь ДНК, которая потом сама уже служит матрицей для синтеза ДНК в
процессе обычной ПЦР.

4.

ПЦР (И ОТ-ПЦР) В РЕАЛЬНОМ
ВРЕМЕНИ
4
Этот метод еще называют qPCR (quantitative PCR, или
количественная ПЦР), поскольку он позволяет не
только обнаружить в пробе целевую нуклеотидную
последовательность, но и измерить количество ее
копий.
Этой матрицей может быть как ДНК (qPCR), так и РНК
(RT-qPCR).
Метод real-time PCR не требует визуализации продуктов
реакции с помощью гель-электрофореза — их накопление
фиксируют в реальном времени оптические датчики,
вмонтированные в амплификатор и настроенные на
определенную длину волны, испускаемую
флуоресцирующими метками. При этом используют два типа
меток: интеркалирующие агенты («коллеги» EtBr) и зонды
с флуорофорами.
Рисунок 2. Амплификатор для
qPCR CFX384 Touch™ от Bio-Rad.

5.

5
ПЦР (И ОТ-ПЦР) В РЕАЛЬНОМ
Рисунок 3. Некоторые виды
ВРЕМЕНИ
меток для ПЦР в реальном
времени.

6.

ИММУНО-ПЦР В
РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Рисунок 4. Схема иммуно-ПЦР в
реальном времени.

7.

ВАРИАНТЫ
ПРОВЕДЕНИЯ
РЕАКЦИИ

8.

ПЦР С ГОРЯЧИМ СТАРТОМ
8
Рисунок 5. Схема ПЦР с
горячим стартом
Antibody – Антитело
Antibody linked Inactive Taq DNA polymerase - Связанная с антителами неактивная ДНК-полимераза Taq
Hot start step of the reaction - Стадия горячего запуска реакции
Antibody is dissolved & Taq DNA pol is activated - Антитело растворяется, и активируется Taq DNA pol
Amplification ofTemplate DNA - Амплификация матричной ДНК
Specific PCR amplicon (No dimer and non-specific bands) - Специфичный ампликон для ПЦР (без димеров и
неспецифических полос)

9.

9
СТУПЕНЧАТАЯ
ПЦР
Первый отжиг между праймером и
ДНК происходит при начальной
температуре, второй — после того,
как температура была снижена на .
Следовательно, продукт второго
отжига находится в невыгодном
положении из-за .
Рисунок 6. Схема ступенчатой ПЦР.

10.

10
«ХОЛОДНАЯ» ПЦР
Рисунок 7. Схема «холодной» ПЦР.

11.

11
ПЦР ДЛИННЫХ ФРАГМЕНТОВ
Рисунок 8. Схематическое
изображение механизма ПЦР
Фотография геля,
содержащего маркерную
ДНК в первом и последнем
слоте (дорожке) и продукты
ПЦР в остальных слотах
(дорожках)

12.

12
МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ПЦР
Рисунок 9. Результаты мультиплексной ПЦР
ДНК пациента с миодистрофией Дюшенна.
К дистрофии приводят различные
мутации экзонов гена белка
дистрофина. На дорожке 7 нет полосы,
соответствующей экзону 48 (длиной
506 п.н.) этого гена.

13.

13
RANDOM AMPLIFICATION OF POLYMORPHIC
Рисунок 10. Схема RAPD
DNA (RAPD)
анализа (Williams et al., 1990)

14.

14
АСИММЕТРИЧНАЯ ПЦР
Рисунок 11. Схема
асимметричной ПЦР

15.

15
МЕТИЛСПЕЦИФИЧНАЯ ПЦР
Рисунок 12. Тест на
наличие/отсутствие
метилирования
Test for presence/absence of methylation Тест на наличие/отсутствие
метилирования
1. Bisulfite treatment - 1. Обработка
бисульфитом
2. Methylation specific primers/Nonmethylation specific primers + RNAP
extends primers - 2. Праймеры,
специфичные для
метилирования/Праймеры, специфичные
для неметилирования + RNAP расширяет
возможности праймеров

16.

16
ПЦР СО
ВЛОЖЕННОЙ
ПАРОЙ ПРАЙМЕРОВ
Рисунок 13. Схема вложенной ПЦР.

17.

17
ИНВЕРТИРОВАННАЯ
ПЦР
Рисунок 14. Схема инвертированной ПЦР.

18.

18
ПЦР С ПЕРЕКРЫВАЮЩИМИСЯ
ПРАЙМЕРАМИ
Рисунок 15. Схема
ПЦР с
перекрывающимися
праймерами.

19.

19
СБОРОЧНАЯ ПЦР
Рисунок 16. Схема
сборочной ПЦР.

20.

20
ТВЕРДОФАЗНАЯ
ПЦР
Рисунок 17. Схема
твердофазной ПЦР.

21.

21
IN SITU ПЦР
Рисунок 18. Схема
In situ ПЦР.
probe DNA - исследуемая ДНК
Labeling with fluorescent dye - Маркировка
флуоресцентным красителем
Denature& Hybridize - Денатурирование и скрещивание

22.

22
КАПЕЛЬНАЯ ЦИФРОВАЯ ПЦР
Рисунок 19. Схема цифровой ПЦР с
использованием системы QX200™ от Bio-Rad.
Рисунок 20. Автоматическая шприцпипетка ридера капель извлекает
капли из каждой лунки планшета для
ПЦР.

23.

ПОДБОР
ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ
ПРОВЕДЕНИЯ
ПЦР

24.

Праймер — это искусственно синтезированная
короткая цепочка нуклеотидов (15–30 штук),
комплементарная выбранному участку одной из
цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров
обычно соответствует началу
амплифицируемого отрезка, другой — его
концу, но на противоположной цепи. У
праймеров, как и у любого олиго- или
полинуклеотида, есть 3ˊ- и 5ˊ-концы.
База данных NCBI (National Center for
Biotechnological Information, USA) - национальный
центр биотехнологической информации, в числе
прочего предоставляет сведения о структуре
генома живых организмов - о нуклеотидных и
аминокислотных последовательностях.
24