коган. менингококк

1.

ФГБОУ ВО ИГМУ МЗ РОССИИ
кафедра патологической физиологии и КЛД
Лабораторная диагностика
менингококковой инфекции
и гнойных бактериальных
менингитов
Коган Г.Ю.

2.

НТД
Приказ №375 от 23.12 1998г
приложение 3 «МУК по
микробиологической диагностике
менингококковой инфекции и
бактериальных менингитов»
● МУК 4.2.4067-24 « Лабораторная
диагностика менингококковой
инфекции и гнойных бактериальных
менингитов»
● СанПин 3.3686-21 «Санитарно

3.

ИСТОРИЯ
МЕНИНГИТА.
К
особой
группе
жизнеугрожающих
для
человека
и актуальных
заболеваний относится бактериальных менингит.
Первые
упоминания
о
болезни
отмечены:
1. У Артея (II в. До н.э.) и Павла Эгинского (VII в.)
2. Эпидемические вспышки менингита встречались в Италии в I,II и VII
веках.
3. В 1805 г. впервые зарегистрирована и подробно освещена эпидемия
цереброспинального
менингита
в
Женеве.
4. В 60-е годы изучались менингиты в Африке профессором Л.Лапессони.
На огромной территории Африки (более 100 лет) существует устойчивый
очаг заболеваемости (так называемый «менингитный пояс»).
Не смотря на достигнутый прогресс в отношении этиологии и
патогенеза,
а также на развитие новых направлений в антибактериальной терапии и
профилактики,
заболевание
остается
одной
из важнейших причин летальности и инвалидизации.

4.

Менингококковая
инфекция
-
острая
бактериальная инфекция, вызываемая менингококком,
характеризующаяся поражением слизистой ротоглотки,
развитием специфической септицемии, поражением
нервной системы, частым развитием тяжелых осложнений,
нередко приводящих к гибели больного.

5.

классификация
По патогенезу менингиты разделяют на первичные и вторичные.
Первичный менингит развивается без предшествующей общей
инфекции или инфекционного заболевания какого - либо органа, а
вторичный бывает осложнением инфекционного заболевания
(общего и локального).
По распространенности процесса в оболочках мозга выделяют
генерализованные и ограниченные менингиты (например, на
основании головного мозга – базальные менингиты, на выпуклой
поверхности больших полушарий головного мозга –
конвекситальные менингиты).
В зависимости от темпа начала и течения заболевания:
молниеносные;
острые;
подострые (вялотекущие);
хронические менингиты.
По степени тяжести выделяют:

6.

Классификация бактериальных
менингитов
2. По характеру воспалительного процесса в оболочках мозга и СМЖ
- гнойные (преобладание нейтрофильного плеоцитоза);
- серозные (преобладание лимфомоноцитарного плеоцитоза).
3. По этиологии МЕНИНГИТЫ делятся на:
- ГБМ: менингококковый, пневмококковый, гемофильный, стафилококковый,
стрептококковый, энтеробактериальный, гонококковый и др.
- бактериальные серозные менингиты: туберкулёзный, бруцеллёзный,
микоплазменный и др.
- микозные: кандидозный, криптококковый и др.
- менингиты, вызванные простейшими;
- менингиты, вызванные гельминтами.

7.

Наиболее значимыми возбудителями
бактериального менингита являются:
1. N.meningitidis
2. S.pneumoniae
3. H.influenzae
Менингококки классифицируют по составу
полисахарида на 12 серологических групп –
A,B,C,X,Y,Z,W-135,29E,K,L,H,I, но наиболее
чаще встречающих это серогруппы (A,B,C).

8.

До начала антибиотикотерапии с соблюдением правил асептики.
Материал для микробиологического
исследования
СМЖ
Ликвор (1-1,5 мл) в стерильной
пробирке для бактериоскопии и
серологии
КРОВЬ
Кровь, засеянная на двухфазную среду
Ликвор, засеянный на
чашку с «шоколадным»
агаром
Кровь для бактериоскопии
в виде толстой капли
Ликвор, засеянный в 0,1%
полужидкий
питательный агар
Кровь для серологии

9.

Микроскопия нативного материала
Ликвор: на фиксированный мазок наносят 1%
водный раствор метиленового синего на 1
минуту, после чего мазок промывают.
Приготовление «толстой» капли крови: на
середину обезжиренного предметного стекла
пипеткой наносят каплю крови больного,
размазывают ее стеклянной палочкой в виде
бляшки диаметром 1 см. Стекло оставляют в
горизонтальном положении до полного
подсыхания капли. Затем препарат окрашивают
1% водным раствором метиленовой сини в
течение 2-3 минут (без предварительной
фиксации!)

10.

Микроскопия нативного материала

11.

Экспресс-методы
Латекс-агглютинация.
ВИЭФ - метод встречного
иммуноэлектрофореза.
НМФА – непрямой метод
флюоресцирующих антител.
РТГА с антительными эритроцитарными
диагностикумами.
РКА – реакция коагглютинации.
Молекулярно-генетический метод - ПЦР

12.

Экспресс-диагностика: система слайдекс (полимер с
иммобилизованными моноклональными антителами)
определение в ликворе основных возбудителей
менингита, результат в течении 2 минут

13.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭТАП
Исследуемый материал: ликвор, кровь,
носоглоточная слизь, экссудат из петехий,
трупный материал.
Взятие материала: до начала
антибактериальной терапии
Доставка в лабораторию немедленно!
Не допускать охлаждения материала!
Материал сопровождается правильно
оформленным направлением.

14.

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ
БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ
(ЛИКВОР, КРОВЬ)
РЕАКЦИЯ ЛАТЕКСАГГЛЮТИНАЦИИ
(ЛИКВОР, КРОВЬ)
(ЛИКВОР, КРОВЬ)
РЕАКЦИЯ ВИЭФ
(ЛИКВОР, КРОВЬ)
РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМААГГЛЮТИНАЦИИ

15.

Преаналитический этап
Ликвор – вторая порция в
количестве 2-3 мл.
Кровь, взятую стерильно из
вены, засевают во флаконы с
жидкой питательной средой или
в 0,1% полужидкий агар в
соотношении 1:10.

16.

ФЛАКОНЫ ДЛЯ ГЕМОКУЛЬТУР ГЕМОЛАЙН
Съемная
крышка
Отвинчивающаяся
крышка
(СО2 атмосфера)
Агаровый слой
Бульон с
питательными
веществами
Разряжение
рассчитано на
дозирование
10 мл крови

17.

Преаналитический этап
Носоглоточную слизь берут с задней стенки глотки
стерильным ватным тампоном, изогнутым под углом
1350, при помощи стерильного шпателя. Взятая слизь
немедленно засевается на сывороточный агар с
антибиотиком или погружается в транспортную
среду.
Экссудат из петехий - после обработки кожи 70%
спиртом стерильным шприцем вводят 0 ,1- 0,2 мл
физ. раствора в толщу петехии и отсасывают обратно.
Трупный материал: ликвор из околооболочечного
пространства 3-5 мл, кровь из правого сердца 7-10
мл, гной с мягкой мозговой оболочки.

18.

Лабораторная диагностика N.meningitidis
ликвор
кровь
БСК
(окраска МС )
посев на ША
Рост на ША сероватые,
круглые, выпуклые, гладкие,
влажные, блестящие колонии
без гемолиза с ровными краями
ДК- кофейные зерна
окраска по Граму
оксидазный тест
оксидаза – отр.
= не N.m
оксидаза +
= N.m
гр.- кокки
= N.m.
гр. + кокки
= не N.m.
утилизация сахаров
определение СГ
контроль ФР и АГ с АС
другая МФЛ = не N.m.
Г+ (ж)
М+(ж) Ф - (к) С- (к) = N.m.
Антибиотикочувствительность
утилизация других сахаров
= не N.m

19.

Основные требования при работе с
нейссериями
Материал, подозрительный на нейссерии,
транспортируют в утепленных (30-35о С)
контейнерах.
Если поступивший в лабораторию материал не
может быть исследован немедленно, то его
сохраняют в термостате.
Питательные среды требуют наличия многих
аминокислот и витаминов. Используются
коммерческие основы: агар Мюллера-Хинтона,
эритрит-агар, среда для выделения гонококков, агар
по Хоттингеру.

20.

Все дифференциально-диагностические признаки
желательно изучать одномоментно, у
свежевыделенной или претерпевшей 1-2 пересева
культуры, так как патогенные виды мало
жизнеспособны во внешней среде, поэтому в их
культурах «старше» 1-2 суток практически не
содержится живых клеток.
Нахождение посевов вне термостата должно быть
минимальным (не более 10 минут).

21.

22.

АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭТАП
Первый день исследования
Питательные среды: 20% сывороточный агар,
шоколадный агар, сывороточный агар с
ристомицином или линкомицином, 0,1% полужидкий
агар (обогащения)
Перед посевом чашки прогревают в термостате 15-20
минут!
Посев носоглоточной слизи возможен на
сывороточный агар без антибиотика с применением
дисков (не более 2 дисков на одну чашку)
Засеянные чашки помещают в эксикатор, анаэростат
с повышенным содержанием СО2, при 370 С.

23.

24.

Техника посева
Ликвор: 0,3-0,5 мл стерильной пипеткой со дна пробирки
наносят по 2-3 капли материала на поверхность питательной
среды, растирают шпателем
Носоглоточная слизь: материал втирают тампоном,
поворачивая его всеми сторонами на поверхность участка
(1х2 см) среды с антибиотиком, затем этим же тампоном
засевают штрихами (с отрывом) по всей площади среды.
Можно использовать диски с ристомицином или
линкомицином
Трупный материал: посев на месте взятия.
Кровь - 2-3 мл в 25 мл 0,1% п/ж агара
Ликвор – 0,1 мл наносят в центр чашки и распределяют по
поверхности покачиванием
Гной с мозговых оболочек – засевают тампоном штрихами
или газоном на поверхность твердой питательной среды и
опускают тампон в пробирку со средой обогащения

25.

Аналитический этап
Второй день исследования(через 24часа)
Просматривают посевы на ША и СА с целью отбора
подозрительных колоний.
подозрительные колонии:
N . meningitidis - мелкие, около 1,0 мм в диаметре, голубоватоопалесцирующие или прозрачные, без признаков пигмента, при
прикосновении петлей влажные маслянистые.
Определяют: морфологию культуры при окраске по Граму,
наличие каталазы, оксидазы, сахаролитическую активность,
ставят тесты прихотливости
Агглютинация с группоспецифическими антисыворотками
Выделяют чистую культуру путем отсева подозрительных
колоний на скошенный 20% сывороточный агар.
При отсутствии роста – высев со среды обогащения (повторяют
через 1-2 дня при отрицательных результатах в течение 5 дней
инкубации в термостате)

26.

Микроскопия ликвора:
окраска по Калине Neisseria meningitidis

27.

Neisseria meningitidis
на сывороточном агаре

28.

Neisseria meningitidis
шоколадный агар

29.

Тест на оксидазу

30.

Тесты прихотливости
Отсутствие роста на
бессывороточном агаре
Отсутствие роста на средах с 0,2%
желчью
Зависимость роста от СО2
о
Отсутствие роста при 22 С

31.

Другие культуральные и биохимические
свойства
Отсутствие способности к
пигментообразованию (определяется при
посеве чистой культуры на желточный
агар)
Сахаролитическая активность:
ферментация глюкозы и мальтозы до
кислоты, но не сахарозы, лактозы,
фруктозы.

32.

Аналитический этап
третий день исследования (через 48часов)
учет результатов посевов, сделанных на 2 день,
возможна выдача окончательного
положительного ответа.
посевы просматривают окончательно с целью
отбора подозрительных колоний
при росте: мазок, отсев на сывороточный агар,
тесты прихотливости, агглютинация со
специфическими антисыворотками,
антибиотикограмма
при отсутствии роста – предварительный
отрицательный ответ

33.

Аналитический этап
четвертый день исследования
Учет результатов
Серотипирование
Выдача ответа

34.

Лабораторная диагностика
генерализованных форм
менингококковой инфекции.
- обнаружение в нативном материале диплококков с
характерными
морфологическими признаками;
- характерный рост только на высокопитательных средах;
- типичная морфология культурального мазка по Граму;
- сахаролитическая активность в отношении глюкозы и
мальтозы;
- выявление группоспецифических свойств;
- обнаружение специфических антигенов в ликворе и/или
сыворотке крови в реакциях латекс-агглютинации и
ВИЭФ (экспресс-методы);
- детекция специфических антител в сыворотке крови в
реакции РНГА.

35.

Методы серологической идентификации
менингококков (серотипирование)
Реакция агглютинации на стекле
Реакция агглютинации в
полистироловых пластинках
Реакция микропреципитации
Метод ВИЭФ

36.

Определение чувствительности
N.meningitidis.
Менингококки остаются
высокочувствительными к
пенициллину.
- Цефтриаксон;
- цефотаксим.

37.

Определение антибиотикорезистентности
Neisseria meningitidis с помощью Е -тестов

38.

Сроки выдачи и
формулировка ответов
1 день исследования
«При бактериоскопии нативного материала (ликвора,
крови) - обнаружены грамотрицательные
диплококки, морфологически сходные с
нейссериями» (через 1-2 часа). Бактериологическое
исследование продолжается.
На основании экспресс-методов: «В спинномозговой
жидкости выявлен специфический антиген
(менингококковый, пневмококковый или H.influenzae
тип В)». Бактериологическое исследование
продолжается.

39.

Сроки выдачи и
формулировка ответов
2 день исследования: предварительный ответ. При
наличии четко выраженной агглютинации выросшей
культуры с одной из специфических сывороток
возможен окончательный положительный ответ: «При
исследовании спинномозговой жидкости (крови)
получен рост…………»
3 день исследования: возможен окончательный
положительный, предварительный положительный и
отрицательный ответы.
4 день исследования: аналогично 3 дню.
окончательный отрицательный ответ не позднее 5 дня
исследования(последний высев со среды обогащения)

40.

Бактериологическое исследование
крови
После суточной инкубации крови делают высевы со
среды обогащения или с жидкой среды на
сывороточный и шоколадный агары в чашках Петри.
При наличии роста готовят препараты для
микроскопии. При отрицательном результате
рекомендуется инкубация в течение недели с
высевами через день.
Выделение и идентификацию гемокультур проводят
также, как при исследовании спинномозговой
жидкости.

41.

Специфическая профилактика
Применяются отечественные вакцины
против менингококов типа А и С, а также
французская вакцина
«Менинго А+С»
Перспективна поливалентная
менингококковая вакцина с
полисахаридами групп А,С, Y, W-135.

42.

Основные возбудители
гнойных менингитов

43.

N = 77
25,9%
23,4%
50,6%
1
N.m
ГФМИ
2 Hib
3 Str.pn.

44.

Лабораторная диагностика S.pneumoniae
ликвор
кровь
посев на ША
Рост на ША маленьких,
сероватых, влажных, водянистых,
колонний, окруженных зоной альфагемолиза
БСК
(окраска МС )
ДК с капсулой
цепочки
Окраска по Граму
Тест с оптохином
диски 6 мм, 5 мкг
Гр+кокки с
капсулой
альфа-гем.
и >14 мм= Str.pn.
лизис = Str. pn
альфа-гем.
и 9 мм-13 мм
тест с
желчью
другая МФЛ
= не Str.pn.
альфа-гем. и
<8 мм Str. viridans
Другая МФЛ
= не Str.pn.
оптохин-отр.
= не Str.pn.
нет лизиса = не
Str. pn.
Антибиотикочувствительность
диско-диффузионный метод на МХА+5% крови барана или лошади, ATB STREP

45.

Лабораторная диагностика
пневмококковых менингитов
обнаружение в нативном материале (ликвор и/или
кровь) диплококков, окруженных капсулой;
●рост на средах, содержащих кровь с образованием
альфа-гемолиза;
●характерная морфология культурального мазка по
Граму;
●положительная проба с оптохином;
●чувствительность к желчным кислотам;
●выявление специфического антигена в реакции
латекс-агглютинации (экспресс-метод).

46.

Чистая культура
Streptococcus pneumonia с дисками оптохина и
дезоксихолата

47.

Определение чувствительности
S.pneumoniae.
К бета-лактамным антибиотикам:
- пенициллину,
- аминопенициллинам,
- карбапенемам,
- цефалоспоринам.
Дополнительно изучают чувствительность к
макролидам, линкозамидам, ко-тримоксазолу

48.

Лабораторная диагностика H.Influenzae
ликвор
кровь
БСК
(окраска МС )
посев на ША
Рост на ША непрозрачные,
кремовато-серые колонии
без гемолиза
полиморфные
коккобациллы, ниточки
требовательность к ФР
и серотипирование
XV диски
не требуют
XV факторов
роста
= не H. infl.
требуют
XV факторов роста
= Н. infl.
другая МФЛ
= не H.influenzae
Окраска по Граму
Гр-палочки=
H.infl.
Гр+палочки
=не H.infl.
серотипирование с ЛА Hib
агглютинация +
= H. infl. типа b
агглютинация = H. infl. не типа b
Антибиотикочувствительность
на среде НТМ, АТВ HAEM

49.

Лабораторная диагностика ХИБменингитов
обнаружение в нативном ликворе нежных полиморфных
палочек;
●рост только на средах, содержащих Х и V факторы роста
(«шоколадный» агар);
●характерная морфология культурального мазка,
окрашенного по Граму;
●положительная сахаролитическая активность в отношении
глюкозы;
●выявление потребности в Х и V факторах роста;
●детекция специфических Hib-антигенов в реакции латексагглютинации.

50.

Определение чувствительности H.influenzae.
ампициллин,
- ампициллин/сульбактам или
амоксициллин/клавуланат,
- цефуроксин,
- цефотаксим,
- рифампицин,
- ципрофлоксацин,
- хлорамфеникол,
- имипенем,
- меропенем.

51.

«ПРОЧИЕ» ВОЗБУДИТЕЛИ Гнойных
Бактериальных Менингитов
При обнаружении в мазке нативного ликвора или крови
дрожжеподобных грибов, кокков или палочек, имеющих
своеобразную морфологию, отличающую их от основных
возбудителей гнойных бактериальных менингитов,
дополнительно к посеву на чашки с "шоколадным"
агаром необходимо произвести высев материала на
соответствующие питательные среды (дрожжеподобные
грибы – среда Сабуро, кокки – кровяной агар, желточносолевой,палочки – кровяной агар, среда Эндо).

52.

Спасибо за внимание!