Презентация проекта Машлаев М.С

1.

Количественная оценка проявления
онкогенных генов E6/E7
Вируса папилломы человека высокого онкогенного риска методом реал тайм
ПЦР в зависимости от стадии эпителиальных поражений
Докладчик: Машлаев Михаил Сергеевич

2.

Актуальность
Инфекции ВПЧ высокого онкогенного риска (hr-HPV) являются основной
причиной рака шейки матки.
Онкогены E6 и E7 играют ключевую роль, инактивируя супрессоры опухолевого
роста p53 и pRb.
Стандартная ПЦР-диагностика выявляет только наличие ДНК вируса, но не его
онкогенную активность.
Простое носительство ДНК не всегда коррелирует с риском прогрессирования
поражения (вирус может быть неактивен).
Требуется количественная оценка экспрессии (активности) транскриптов E6/E7
для точной стратификации риска.

3.

Проблематика и гипотеза
Отсутствие чётких количественных данных по экспрессии E6/E7 осложняет
стратификацию риска прогрессирования поражений и выбор тактики лечения.
"
Гипотеза исследования:
Уровень проявления онкогенов E6/E7 количественно
увеличивается с прогрессированием стадии поражений
(от NILM до HSIL/рака) и лучше коррелирует с риском,
чем простое присутствие HPV-ДНК.
"

4.

Цель и задачи
Цель: Количественная оценка уровня проявления генов E6/E7 hr-HPV
методом ПЦР в реальном времени и анализ зависимости от стадии
поражений.
Задача 1: Подбор и отбор клинических образцов по стадиям (NILM, LSIL, HSIL).
Задача 2: Идентификация типов hr-HPV в образцах.
Задача 3: Экстракция ДНК/РНК и проведение RT-qPCR для E6/E7.
Задача 4: Количественный расчёт относительного уровня проявления (метод
ΔΔCt).
Задача 5: Статистическая оценка различий уровней экспрессии между группами.
Задача 6: Оценка прогностического значения E6/E7 и разработка рекомендаций.

5.

Обзор методологии
Выборка
Анализ
Оборудование и ПО
N = 60 образцов
Экстракция ДНК (ДНК-сорб-
Амплификатор DT-96. ПО
(урогенитальные соскобы).
АМ / Auto-Pure 96). ПЦР-
для расчета ΔΔCt.
Разделение на 3 группы
скрининг (АмплиСенс-14).
Статистический анализ
Количественный RT-qPCR
(R/Python) для сравнения
(E6/E7).
групп и построения ROC-
(Контроль, CIN I, CIN II/III) по
20 человек.
кривых.

6.

Материалы: клиническая выборка
Группа
Стадия
поражения
Описание
Кол-во (N)
Группа 1
(Контроль)
NILM
Нормальная цитология, отсутствие эпителиальных
поражений.
~ 20
Группа 2
CIN I (LSIL)
Низкая степень плоскоклеточного
интраэпителиального поражения.
~ 20
Группа 3
CIN II/III (HSIL) / Рак
Высокая степень поражения или инвазивная
карцинома.
~ 20
Всего
Таблица 1. Формирование выборки пациентов для исследования.
~ 60

7.

Методы: экстракции ДНК
Ручной метод (ДНК-сорб-АМ)
• Адсорбция ДНК на сорбенте.
• Инкубация при 65°C для лизиса.
• Последовательные отмывки буфером.
• Элюция чистой ДНК.
Автоматический метод (Auto-Pure 96)
• Принцип магнитных частиц (НК-магно).
• Высокая производительность (до 96
образцов).
• Автоматизированный лизис, отмывки
и элюция.
• Минимизация ошибок оператора.
Рис. 1. Лабораторный этап выделения
нуклеиновых кислот.

8.

Методы: ПЦР-Анализ
• Набор: АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-14-FL.
• Цель: Обнаружение и оценка титра 14 типов hrHPV.
Амплификация
• Прибор: Амплификатор DT-96.
• Программа: 45 циклов (95°C, 60°C, 72°C).
• Детекция: Регистрация флуоресценции на
этапе 60°C.
Количественный анализ E6/E7
• RT-qPCR с нормализацией по референс-гену
(β-actin / GAPDH).
• Расчет относительной экспрессии (метод
ΔΔCt).
Рис. 2. Оборудование для ПЦР в реальном
времени (DT-96).

9.

Таблица 2. Используемые контроли (на 60 образцов).
Методы: контроли ПЦР и каналы детекции
Контроль
Назначение
Кол-во
ПКО (Положительный)
Проверка работоспособности реакционной смеси.
1
ОКО (Отрицательный выделения)
Контроль чистоты реагентов на этапе выделения ДНК.
1
К- (Отрицательный ПЦР)
Контроль контаминации на этапе постановки ПЦР.
1
Таблица 3. Каналы детекции флуоресценции (DT-96).
Канал
Определяемый объект
FAM
ВПЧ 16 типа
HEX
ВПЧ 18 типа
Cy5.5
ВПЧ 45 типа
ROX
14 типов ВПЧ (общий)
Cy5
Внутренний контроль (контроль взятия материала)

10.

План реализации проекта
Этап 2 (3-6 мес)
Этап 4 (10-11 мес)
Сбор материала:
Статистика: Расчет
Формирование
ΔΔCt, сравнение групп,
выборки N=60
построение ROC-
(Контроль, CIN I, CIN
кривых.
II/III).
Этап 1 (1-2 мес)
Этап 3 (7-9 мес)
Этап 5 (12 мес)
Подготовительный:
Лабораторный анализ:
Отчетность:
Разработка
Выделение ДНК/РНК,
Подготовка статьи,
протоколов, этика,
проведение RT-qPCR
доклад на
закупка реагентов.
для E6/E7.
конференции,
итоговый отчет.

11.

Ожидаемые результаты (модель)
Диаграмма 1. Ожидаемое повышение уровня экспрессии E6/E7 в зависимости от стадии.
Ожидается статистически значимое (p < 0.05) увеличение относительной экспрессии
E6/E7 при переходе от низкой (LSIL) к высокой (HSIL) степени поражения, что
подтвердит гипотезу.

12.

Соответствие стратегии НТР РФ
Направление Н3
Персонализация
Проект соответствует приоритету Н3:
Разработка теста на основе RT-qPCR для
«Переход к персонализированной
E6/E7 позволит перейти от простого
медицине, высокотехнологичному
выявления ВПЧ к персонализированной
здравоохранению и технологиям
стратификации риска, основанной на
здоровьесбережения».
онкогенной активности вируса.

13.

Научный задел и ресурсы
Руководитель и команда
Руководитель специализируется на
молекулярной диагностике, обладает
опытом полного цикла RT-qPCR
исследований, включая расчет ΔΔCt.
Команда: 1 молекулярный биолог
(исполнитель), 2 лаборанта.
Оборудование
Имеется: Амплификатор DT-96,
Рис. 3. Руководитель проекта.
Ламинарный бокс II класса, ПО (R/Python).
Требуется (План закупок): Пипетки,
микроцентрифуги, наборы для выделения,
праймеры и зонды к E6/E7.

14.

Смета проекта (1 год)
Таблица 4. Основные статьи расходов. Общий бюджет: 1 500 000 руб.
Направление расходов
Сумма, руб.
Обоснование
Вознаграждение (Коллектив +
Вспом.)
600 000
Оплата труда руководителя, исполнителя и лаборантов.
Материалы и комплектующие
400 000
Наборы для выделения ДНК, реагенты ПЦР, праймеры и
зонды E6/E7.
Оплата НИР сторонних организаций 200 000
Накладные расходы организации
(10%)
150 000
Оборудование (сервис) и Иные
расходы
150 000
ИТОГО
1 500 000
Валидационное секвенирование, гистологическая
верификация.
Калибровка пипеток и амплификатора, оплата
публикаций.

15.

SWOT- анализ проекта

16.

SWOT-анализ: внутренняя среда
Таблица 5. Сильные (S) и Слабые (W) стороны.
Сильные стороны (Strengths)
Слабые стороны (Weaknesses)
Опыт руководителя в RT-qPCR (полный цикл, ΔΔCt).
Дефицит оборудования (пипетки, центрифуги).
Наличие ключевой инфраструктуры (Амплификатор
DT-96, Ламинарный бокс).
Зависимость от внешних НИР для верификации
(гистология, секвенирование).
Проработанный план и дизайн исследования.
Необходимость калибровки имеющегося
оборудования.
Поддержка ПО для статистики и анализа данных
(R/Python).

17.

SWOT-анализ: внешняя среда
Таблица 6. Возможности (O) и Угрозы (T).
Возможности (Opportunities)
Угрозы (Threats)
Высокая актуальность темы, соответствие НТР РФ (Н3).
Сложности с набором пациентов (особенно
группы HSIL).
Реальный диагностический потенциал (создание
протокола).
Задержки в поставках реагентов и праймеров
E6/E7.
Возможность публикации в высокорейтинговых
журналах.
Высокая сложность статистической обработки
данных.
Формализация и внедрение методики в клиническую
практику.

18.

Вывод по SWOT-анализу
"
Проект имеет сильный научно-методический
фундамент (компетенции в RT-qPCR, инфраструктура)
и адресует актуальную задачу. Ключ к успеху оперативно закрыть дефицит оборудования (закупки) и
строго управлять качеством и статистикой. Это
позволит подготовить воспроизводимый протокол с
реальным диагностическим потенциалом.
"

19.

Спасибо за внимание