Лабораторная диагностика сибирской язвы

1.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
Семейство: Bacillaceae
Род: Bacillus
Вид: Bacillus anthracis

2.

В 1786-1789 гг. в Уральском наместничестве (Западная Сибирь) среди животных
и людей было широко распространено заболевание, сопровождающееся высокой
смертностью. С.С. Андреевский прибыл из Санкт-Петербурга для изучения
причин этой инфекции. Для доказательства заразительности болезни он произвел
самозаражение – ввел себе под кожу жидкость из карбункул. Болезнь протекала
тяжело, но закончилась выздоровлением. В 1788 г. он представил в медицинскую
коллегию Санкт-Петербурга подробное сочинение “О сибирской язве”.
Андреевский разработал и внедрил систему карантинных мер, сжигание трупов
павших животных и правила по уходу за больными.
Можно сказать, что Андреевский – первооткрыватель болезни. А Челябинск
часто называют «родиной сибирской язвы».

3.

Микроскопически бацилла сибирской язвы была
обнаружена в 1849 г. немецким врачом А. Поллендером
в 1876 г - выделена в чистой культуре Р. Кохом
В 1881 году французский микробиолог и химик Луи Пастер создал
прививку против сибирской язвы для животных.
Впервые вакцина для человека была создана в 1940 году
сотрудниками Санитарно-технического института Красной армии (г.
Киров) Николаем Гинсбургом и Александром Тамариным.
B. anthracis, окраска
по Граму
Рост B. кровяном
агареanthracis на

4.

СИБИРСКАЯ ЯЗВА
Особо опасное инфекционное заболевание, поражающее кожу, легкие и
кишечник.
Бактерия, которая вызывает это заболевание - Bacillus antracis, или
сибиреязвенная палочка, получила свое название от греческого слова
anthrakos — «уголь» — из-за способности образовывать черные, похожие
на угольки, струпья на коже.
Bacillus antracis очень хитрая и жизнелюбивая: как только ей что-то не по
душе, она тут же превращается в спору и прекрасно переживает
неблагоприятный период своего существования.

5. Сибирская язва

6.

Споры сибирской язвы — это крайне устойчивая форма
бактерии Bacillus anthracis, способная сохранять жизнеспособность в
почве и окружающей среде десятилетиями (до 100 лет), выдерживая
замораживание, высушивание и многие дезинфектанты.
Попадая в благоприятную среду, чаще всего в организм человека или
животного, спора превращается в вегетативную форму, начинает
активно размножаться и выделять токсин, запуская таким образом
процесс заболевания.

7.

Именно поэтому бактерия так понравилась военным. Ведь это - идеальное
биологическое оружие для поражения максимального количества живых
существ в минимальные сроки. Распылив споры сибирской язвы, можно на
сотни лет загрязнить огромные территории до непригодного для жизни
состояния. А из-за малого размера споры идеально проникают в легкие и
стремительно поражают их.
В 1915 году в ходе Первой мировой войны Германия и Франция перегоняли
зараженный сибирской язвой скот — лошадей и коров — на сторону противника.
В 1940-х годах на британской экспериментальной станции ПортонДаун доктор Пол Филдс определил, что наиболее эффективный способ
применения сибирской язвы как биологического боевого агента — распыление
частиц при взрыве бомбы. В 1942 году он провел серию экспериментов с
бактериологическим оружием на пустынном шотландском острове Грюинард,
куда доставили отару овец, после чего туда же сбросили бомбы, начиненные
спорами сибирской язвы. Все овцы погибли в течение нескольких дней, а земля
острова на протяжении долгих десятилетий оставалась зараженной и
непригодной для жизни.

8.

Остров Грюинард

9.

Военный городок Свердловск-19, 1979 год. Внезапная вспышка сибирской
язвы унесла жизни 64 людей — и это только по официальным данным. По
неофициальным (со слов врачей и пациентов) — не меньше сотни.
Подавляющее большинство инфицированных были мужчинами средних лет.
Годы спустя президент Борис Ельцин признал, что причиной эпидемии стали
секретные разработки, а именно — случайная утечка бактерий из военной
лаборатории.
Советский химик Лев Фёдоров, автор книги «Советское биологическое
оружие: история, экология, политика», утверждал: «Военные биологи тогда
„потеряли“ сибирскую язву, и облако „ушло“ на город — погибло много
людей: по официальным данным, 64 человека, по моим — порядка 500!
Ветер тогда дул в конкретном направлении: на пути были зоны для
заключённых, новый керамический завод с хорошей воздухозаборной
системой, попались и те, кто утром шёл на работу»
В 1993 году в Токио религиозная секта предприняла попытку ускорить
наступление апокалипсиса путем распыления спор сибирской язвы через
вентиляционную систему. По счастливой случайности, вместо смертельно
опасных спор сектантам досталась всего лишь ветеринарная вакцина против
сибирской язвы, и никто не пострадал (если не считать неприятного запаха
из вентиляции).

10.

Bacillus anthracis
крупная грам+ палочка (1,0 - 1,5 х 6-8 мкм), неподвижная, с
обрубленными концами, располагается в виде цепочек («бамбуковая
трость»), парами или поодиночке
В организме восприимчивых животных и человека, а также при росте на
богатых белком искусственных питательных средах образует капсулу,
что характерно для вирулентных штаммов.
При неблагоприятных для жизнедеятельности вегетативной формы
условиях — вне организма, образует споры овальной формы,
расположенные центрально.
Факультативный аэроб.

11.

В России ежегодно регистрируются вспышки болезни сибирской язвы среди
животных, приводящие к инфицированию людей.
Источник инфекции сибирской язвы является домашний скот и дикие
животные.
Чаще болеют овцы, крупный рогатый скот, лошади, козы, буйволы,
верблюды и северные олени, могут заражаться ослы и мулы. Свиньи
менее чувствительны.
Домашняя птица к инфекции нечувствительна.

12.

СИБИРСКАЯ ЯЗВА – СТАЦИОНАРНАЯ БОЛЕЗНЬ
Сибирской язве свойственна стационарность — неоднократное повторение
вспышек болезни в ранее неблагополучных местностях .
Связано это прежде всего с длительным сохранением спор возбудителя во
внешней среде.

13.

Заражение животных происходит преимущественно алиментарно.
Через поврежденную слизистую пищеварительного тракта бактерия проникает в
лимфатическую систему, а затем в кровь, разносится по всему организму.
Экзотоксин разрушает фагоциты, поражает ЦНС, вызывает отек. В терминальной
фазе процесса в крови снижается содержание кислорода до уровня,
несовместимого с жизнью.

14.

Заражение человека происходит через прямой или
косвенный контакт с больным животным.
ПУТИ ПЕРЕДАЧИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
• контактный (наиболее распространенный) – уход за инфицированными
животными и их забой; когда человек с ранее существовавшим повреждением
кожи непосредственно контактирует со спорами сибирской язвы;
• алиментарный – употребление сырого или не доготовленного мяса
инфицированного животного;
• воздушно-капельный – вдыхание воздуха, обсемененного спорами
сибиреязвенной палочки.
Сибирской язвой нельзя заразиться от другого человека как простудой или
гриппом. В редких случаях сообщается о передаче кожной формы
сибирской язвы от человека к человеку, поскольку выделения из поражений
на коже могут быть заразными.

15.

В зависимости от путей передачи выделяют четыре формы сибирской язвы:
кожную, легочную, кишечную и септическую.

16.

К сожалению, только кожная форма может похвастаться частым
благоприятным исходом, все остальные нередко заканчиваются смертью
больного.
Спустя 2-14 дней после заражения у больных наблюдается сильнейшая
интоксикация, сопровождающаяся головной болью, повышением
температуры тела до 40 градусов, а через несколько дней - резким
падением температуры ниже нормы. На коже появляются язвы, они
безболезненны, что характерно для сибиреязвенного карбункула, а еще
его отличительная черта - трехцветная окраска: в центре черный струп,
вокруг желтоватая кайма, а далее – багровый широкий вал. При редких
кишечной и легочной формах больные жалуются на кашель с кровью,
одышку, боли в животе, тошноту, рвоту, жидкий стул с кровью.
На исход заболевания часто влияет своевременно начатое лечение большие дозы внутривенных и пероральных антибиотиков.

17.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Bacillus anthracis
Факультативный анаэроб
Хорошо растет на простых питательных средах:
МПБ, МПА, МПЖ, рН 7,2-7,5 при 37ºС в течение
18-20 часов
При росте сибиреязвенных бацилл в бульоне
появляется осадок на дне пробирки или флакона,
который напоминает комочек ваты, бульон же
остается прозрачным.
Бациллы при посеве уколом на желатине растут в
виде елочки, перевернутой вниз верхушкой.

18.

Рост на МПА
Рост в МПБ
Рост на МПЖ

19.

20.

Гемолитические свойства
В отличие от сходных бацилл возбудитель сибирской
язвы не обладает подвижностью, не дает гемолиза на
кровяном агаре.

21.

ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ
Капсула – антифагоцитарная активность
Экзотоксин термолабильный, угнетает бактерицидную
активность гуморальных и клеточных факторов
организма. Представлен комплексом из 3 факторов:
- фактора отечности, повышающего проницаемость
сосудов
- протективного антигена, индуцирующего синтез
защитных антител
- фактора летальности, вызывающего смерть животных
Токсино- и капсулообразование
кодируются двумя плазмидами
( pXO1, pXO2). Утрата плазмид
приводит к потере вирулентности

22.

Основные методы диагностики:
1.Бактериоскопический метод. Из поступившего в лабораторию материала готовят
мазки, окрашивают по Граму (Грам+ палочки); по методу Михина, Ольта,
Романовского-Гимзе (обнаружение капсулы).
2.Бактериологический метод (посев на МПА, МПБ, тест жемчужного ожерелья,
чувствительность к бактериофагу).
3.Биологический метод (биопроба на морских свинках, белых мышах и кроликах).
4. Молекулярно-генетический метод (ПЦР): Обнаружение специфических генов.
5. Иммунологические методы: метод флюорисцирующих антител (МФА), реакция
преципитации (Асколи) для обнаружения антигенов.
6. Исследование на подвижность проводят микроскопическим методом
раздавленной капли. Возбудитель сибирской язвы неподвижен.
Важно: Все работы с подозрительным материалом проводятся в лабораториях,
имеющих разрешение на работу с возбудителями I-II групп патогенности

23.

РИФ

24.

по Граму
по Ребигеру

25.

РИФ с сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой является одним из методов
экспресс-диагностики сибирской язвы. Для люминесцентной микроскопии мазки
готовят из патологического материала, из подозрительных колоний, из материала,
взятого от биопробных животных. На высохшие и фиксированные мазки наносят
сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные иммуноглобулины. Этим
методом можно выявить в пробах сибиреязвенные микробы в споровой или
вегетативной форме. При наличии в пробе вегетативных клеток обнаруживаются
палочки, окруженные ободком зеленоватого цвета

26.

Бактериологическое исследование направлено на выделение чистой культуры и ее
идентификацию для окончательного подтверждения диагноза. Для посева
исследуемого материала используют МПА и МПБ. Посевы инкубируют при 36-37 ℃
в течение 18-24 часов.
Для выделения чистой культуры, особенно из загрязненного материала, используют
также лабораторных животных (морских свинок, белых мышей). Исследуемый
материал вводится подкожно (морским свинкам – в паховую область, белым мышам –
в корень хвоста). Мышам вводят по 0,2-0,5 мл, свинкам – по 0,5-1,0 мл. Морские
свинки обычно погибают через 2-4 суток, а белые мыши – через 1-2 суток. При
наличии сибиреязвенного микроба у лабораторных животных отмечается характерная
патологоанатомическая картина: отек в месте введения материала, темная не
свернувшаяся кровь, кровоизлияния в клетчатке, рыхлая селезенка. В мазкахотпечатках из внутренних органов и в препаратах, приготовленных из крови,
обнаруживаются грамположительные палочки, окруженные капсулой.
Чистую культуру пересевают на скошенный МПА и инкубируют при температуре
37℃ в течение 4 суток для получения споровой культуры. Идентификацию
выделенной культуры проводят на основании изучения характера роста микроба на
питательных средах, подвижности, капсулообразующей способности, теста
жемчужного ожерелья, чувствительности к бактериофагу. Дополнительно определяют
лецитиназную, фосфатазную и гемолитическую активность культуры.

27.

Лецитиназную активность проверяют на агаре с добавлением куриного
желтка или в жидкой желточной среде. Сибиреязвенный микроб не
свертывает желток в жидкой среде в течение нескольких суток. При росте на
плотной среде вокруг колоний сибиреязвенного микроба мутная белая зона
не образуется, так как возбудитель сибирской язвы не обладает лецитиназной
активностью.
Фосфатазную активность проверяют на питательном агаре, содержащем
фенолфталеинфосфат натрия. Посевы на этой среде инкубируют при 37 ℃ в
течение 18-24 часов. Перед просмотром посевов в крышку чашки вносят
раствор аммиака и через 1 минуту учитывают результаты. Под действием
паров аммиака происходит окрашивание в розовый цвет колоний
микроорганизмов, обладающих фосфатазной активностью. Сибиреязвенный
микроб фосфатазной активностью не обладает, поэтому его колонии
остаются бесцветными.
Гемолитическую активность проверяют при посеве исследуемой культуры
на кровяной агар (3-5%) или в бульон с кровью. Результаты учитывают через
16-20 часов инкубирования посевов в термостате при 37 ℃. Возбудитель
сибирской язвы гемолитической активностью не обладает, поэтому вокруг
колоний зоны гемолиза не образуется.

28.

ТЕСТ НА ЛЕЦИТИНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ
B. cereus
B. anthracis

29.

Сибиреязвенный микроб лизируется специфическими
бактериофагами. Проба с бактериофагами проводится на плотной
питательной среде путем нанесения капли суспензии бактериофага на
предварительно высеянную культуру. Можно использовать также метод
стекающей капли, при котором после нанесения капли суспензии
бактериофага чашку наклоняют. Капля суспензии бактериофага при этом
стекает по поверхности агара. Результат исследования в виде
стерильного пятна или фаговой дорожки (отсутствие роста культуры)
обнаруживается через 18-24 часа инкубирования при температуре 36℃

30.

Тест «жемчужного ожерелья» (феномен ожерелья) — это
микробиологический метод дифференциации возбудителя сибирской язвы
(Bacillus anthracis) от родственных бацилл. Он основан на
чувствительности сибиреязвенной палочки к пенициллину: при росте на
среде с антибиотиком бактерии образуют характерные цепочки
шарообразных сферопластов, напоминающие ожерелье.
Под действием пенициллина у бактерии нарушается синтез клеточной
стенки, но она не погибают сразу, а превращаются в сферопласты,
оставаясь в цепочке.

31.

32.

Серодиагностика проводится в тех случаях, когда возбудитель
сибирской язвы не обнаруживается в исследуемом материале.
Реакция кольцереципитации по Асколи чаще всего используется для
выявления сибиреязвенного возбудителя в различных субстратах
(кожевенном сырье, изделиях из кожи и шерсти, мясе, почве,
испражнениях). Эта реакция позволяет определять наличие
сибиреязвенного антигена как в свежем, так и в разложившемся сырье
или мумифицированных трупах животного.
Компонентами этой реакции являются экстракт исследуемого материала и
преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Для приготовления
экстракта материал заливают физиологическим раствором, кипятят в
течение 10-45 минут и фильтруют. Иммунную преципитирующую
сыворотку (0,2-0,3 мл) вносят в специальную узкую преципитационную
пробирку и на нее осторожно наслаивают равное количество
исследуемого экстракта. На границе соприкосновения компонентов в
течение 1-5 минут образуется мутное кольцо преципитации белого цвета,
что расценивается как положительный результат.

33.

РЕАКЦИЯ КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ
АСКОЛИ
Исследуемый материал – смывы со струпьев, шкур,
шерсти, органов павших животных и др.

34.

Биологическая проба.
Для постановки биологической пробы используют белых
мышей, морских свинок, кроликов. Заражение лабораторных
животных исходным материалом является обязательным
этапом диагностики. Исследуемый материал вводится
подкожно. Гибель зараженных животных наступает через 1-3
суток. Павших животных вскрывают, делают мазки-отпечатки
их тканей и органов и посевы на МПА. При вскрытии
животных отмечается характерный для сибиреязвенной
инфекции студенистый геморрагический отек подкожной
клетчатки в месте введения материала, гиперемия внутренних
органов, увеличение селезенки и несвернувшаяся кровь. В
мазках обнаруживаются сибиреязвенные бациллы в виде
коротких цепочек, окруженных капсулой. В посевах вырастают
типичные для сибиреязвенного микроба шероховатые колонии.

35.

Аллергологическое исследование. Для ретроспективной диагностики
сибирской язвы используется кожная аллергическая проба с
антраксином.
Антраксин вводят внутрикожно в ладонную поверхность предплечья в
объеме 0,1 мл. Результат учитывают через 24-48 часов. Пробу считают
положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром
более 15 мм.

36.

ПРОФИЛАКТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
В РФ выпускают 2 сибиреязвенные вакцины:
1. Вакцина сибиреязвенная СТИ живая сухая для накожного и подкожного
применения. Состоит из спор авирулентного (безкапсульного) штамма
сибиреязвенного микроба
2. Вакцина сибиреязвенная СТИ комбинированная для подкожного
применения. Состоит из спор авирулентного (безкапсульного) штамма
сибиреязвенного микроба и очищенного концентрированного
протективного сибиреязвенного антигена

37.

ЛЕЧЕНИЕ
Терапия проводится
антибиотиками
(бензилпенициллин,
тетрациклин, левомицетин) в
сочетании с
противосибиреязвенным γглобулином или
противосибиреязвенной
сывороткой.
Хирургические
вмешательства могут
привести к генерализации
процесса.
При кожной форме местно
применяют повязки с борной
кислотой или пенициллиновой
мазью для ускорения
репаративных процессов;
производят обкалывание очага
поражения пенициллином.