Основы современной иммуногематологии

1.

Основы современной
иммуногематологии
2014 г.

2.

Нормативные документы, определяющие перечень
и объём иммуногематологических исследований
пациентов
1. Прикази доноров
МЗ РФ :№ 2 от 09.01.1998 г. «Об
утверждении инструкций по иммуносерологии»
2. Требования к проведению
иммуногематологических исследований доноров и
реципиентов на СПК и в ЛПУ: Метод. Указ. МЗ РФ
№ 2001/109, 2002 г.
3.
Постановление правительства РФ № 1230 от
31.12.2012 «Об утверждении правил и методов
исследований и правил отбора образцов донорской
крови, необходимых для применения и исполнения
технического регламента о требованиях
безопасности крови, её продуктов,
кровезамещающих растворов и технических
средств, используемых в трансфузионноинфузионной терапии»

3.

В настоящее время вместе с эритроцитарными
антигенами открыто более 500 антигенов клеток крови
и белков плазмы, которые создают свыше 40
различных антигенных систем крови, сочетания же
различных антигенных систем образуют в
человеческой популяции множество антигенных
комбинаций.
Поэтому, несмотря на подбор донора и реципиента
по системам АВО эритроцитов, всегда имеется
несовместимость в других антигенных структурах их
крови, приводящая к иммунизации организма
реципиента.

4.

На мембранах лейкоцитов помимо антигенов
системы ABO, MN, Левис содержатся антигены
гистосовместимости HLA (от Human Leucocyte
Antigens), представленные более чем 150
антигенами, а также антигены нескольких других
генетических систем — NA, NB, NC, ND, NE и др.
Лейкоцитарные антигены находятся в растворимой
форме в плазме крови, присутствуют на
поверхности других клеток крови.

5.

Антигены гистосовместимости HLA представлены и на
поверхности тромбоцитов. Несовместимость по
антигенам HLA комплекса у донора и реципиента при
переливании цельной крови и ее компонентов
(лейкоцитарной или тромбоцитарной массы) приводит к
иммунизации реципиента. Образовавшиеся в организме
реципиента антитела против антигенов системы HLA
или антигенов лейкоцитов NA-NE при повторном
переливании крови реципиенту вызывают различные
осложнения (лихорадку, возникающую в результате
освобождения пирогенных веществ из поврежденных
антителами лейкоцитов; антитела вызывают
разрушение донорских лейкоцитов и тромбоцитов и
др.).

6.

Антигены эритроцитов:
Структурные компоненты
мембран эритроцитов
Передаются по наследству
Обладают
иммуногенностью
(вызывают выработку
антител)
Взаимодействуют с
антителами, образуя
комплекс антиген-антитело

7.

В настоящее время известно 236
антигенов эритроцитов, которые
объединены в 29 систем.
Большинство антигенов эритроцитов
крови человека было открыто при изучении
причин посттрансфузионных осложнений
гемолитического типа или гемолитической
болезни новорожденных и получило название
по имени лиц, у которых обнаружена данная
патология.

8.

АНТИГЕНЫ
ЭРИТРОЦИТОВ
СИСТЕМЫ АВО

9.

Особенность системы АВО
• Характерной особенностью, отличающей
систему антигенов эритроцитов АВО от
других
систем
антигенов,
является
постоянное присутствие в сыворотках
людей (кроме лиц с группой АВ) антител,
направленных к антигенам А или В.
• Антитела к антигенам эритроцитов других
систем не являются врожденными и
вырабатываются вследствие антигенной
стимуляции.

10.

Характеристика анти-А и
анти-В антител
•Естественные антитела анти-А, анти-В
принадлежат к иммуноглобулинам класса М.
•Выработанные в процессе иммунизации А
и В антигенами анти-А и анти-В антитела
являются иммунными и принадлежат к
иммуноглобулинам класса G.

11.

Характеристика антигенов А и В
У взрослых людей на
эритроцитах могут присутствовать
следующие антигены системы
АВО: А, В, Н.
Антиген Н является
предшественником антигенов А и
В, а также обнаруживается на
поверхности эритроцитов,
принадлежащих к группе крови О, в
незначительном количестве в
группах крови А, В и АВ.
Антигены А, В и Н по
химической природе являются
гликолипидами и гликопротеинами.
0(I)
A(II)
B(III)
AB(IV)
Галактоза
Фукоза
N-ацетилгалактозамин

12.

Антигены и антитела системы АВ0
Группа крови
Антигены на
эритроцитах
Антитела в
сыворотке
O (I)
___
Анти-А, анти-В
A (II)
А
анти-В
B (III)
В
анти-А
AB (IV)
А,В
___

13.

Варианты антигенов А и В
•В 1911 году было установлено, что существует две
подгруппы А антигена: А1 и А2. Среди европейцев 80 %
индивидов, принадлежащих к группе А, имеют подгруппу
А1, остальные 20% принадлежат к подгруппе А2.
•В 1956 году описана А3 подгруппа антигена А.
Антигены А: А2, А3, Ах, не являются разными
антигенами, а представляют собой варианты антигена А
•Слабые формы В антигена также существуют: В3, Вх,
Вw, но они крайне редки среди населения Европы, чаще
встречаются среди населения Китая.

14.

Различия между А1 и А2 антигенами
качественными и количественными.
являются
Слабый антиген
агглютинацию.
позднюю
А2
даёт
слабую
В результате ошибочно
кровь А2 может быть отнесена к О (I) группе
А2В — к В (III) группе крови
и

15.

А1> А2> А3> ...Ах

16.

РЕЦИПИЕНТАМ С ГРУППОЙ КРОВИ А2,3,4 —
х (II) НЕОБХОДИМО ПЕРЕЛИВАТЬ ОТМЫТЫЕ
ЭРИТРОЦИТЫ О (I), СЗП — А(II)
РЕЦИПИЕНТАМ С ГРУППОЙ КРОВИ А2,3,4В
(IV) - НЕОБХОДИМО ПЕРЕЛИВАТЬ ОТМЫТЫЕ
ЭРИТРОЦИТЫ В (III), СЗП — АВ (IV)
РЕЦИПИЕНТАМ С ГРУППОЙ КРОВИ АВ2 —
(IV) НЕОБХОДИМО ПЕРЕЛИВАТЬ ОТМЫТЫЕ
ЭРИТРОЦИТЫ А (II), СЗП — АВ (IV)

17.

АНТИГЕНЫ
ЭРИТРОЦИТОВ
СИСТЕМЫ РЕЗУС

18.

Разновидности антигена D
• Антиген D состоит из структурных единиц – эпитопов.
• Нормально выраженный D антиген: на эритроцитах присутствуют
все эпитопы (большинство индивидов).
• D слабый: сниженное количество (в 3-10 раз) антигенных
детерминант на эритроцитах.
• D вариантный: количество антигенных детерминант не снижено,
но они отличаются качественно.
• Варианты антигена D (слабый, вариантный) встречаются редко.

19.

Антигены системы Резус
С
с
D
E
e
встречаются со следующей частотой:
• D – 85%
• C – 70%
• Е – 30%
• с – 80%
• е – 97,5%

20.

* Антигена d не существует
* dd обозначает отсутствие в
фенотипе антигена D
* Dd – генотип гетерозиготы по
этому признаку

21.

ссddее D — отрицательный , Rh-отрицательный
(реципиент и донор)
сСddее D — отрицательный, Rh-положительный
донор, но резус — отрицательный реципиент
ссddЕе D — отрицательный , Rh-положительный
донор, но резус — отрицательный реципиент

22.

Частота встречаемости фенотипов системы резус
CcDее – 34%
ССDее – 19,5%
СсDЕе (полный фенотип) – 14%
ссddее (D и резус – отрицательный) – 13%
ссDЕе – 12%
ссDее – 3%
сDЕЕ – 2,9%
Ссddее – 1%
СсddЕе – 0,5%
ссddЕе - 0,1%

23.

С
w – встречается у 2% людей
СсС Dее
w
(вариант фенотипа)

24.

Антитела к антигенам эритроцитов
системы Резус
• Главным отличием системы Резус от системы АВО является то,
что в крови людей содержатся только антигены этой системы, а
антител по отношению к ним, подобных антителам анти-А и анти-В
системы АВО, обычно в норме у людей не имеется.
• Антитела к антигенам системы Резус являются иммунными
антителами и появляются в организме в результате трансфузий
эритроцитов доноров, содержащих антигены, отсутствующие у
реципиентов, а также при иммунизации матери эритроцитами
плода.
• Частота встречаемости антител к антигенам системы Резус
различна и определяется иммуногенностью антигенов и частотой их
встречаемости в популяции.
• Чаще всего в России в крови доноров и реципиентов выявляются
анти-D антитела.

25.

Иммуногенность антигенов системы Резус представлена
следующим образом:
D>c>E>Сw>C>e

26.

Определение групп крови проводят:
• По
антигенам,
содержащимся
в
исследуемых
эритроцитах, в этом случае для исследования
используют
стандартные
изогемагглютинирующие
сыворотки или моноклональные антитела (цоликлоны);
• По
антигенам,
содержащихся
в
исследуемых
эритроцитах,
и
антителам,
содержащимся
в
исследуемой сыворотке. В этом случае используют
стандартные изогемагглютинирующие сыворотки или
моноклональные антитела, а также стандартные
эритроциты групп А, В и О (перекрестный метод).

27.

Материал для исследования
Определение производится в нативной крови,
взятой в консервант (цитрат натрия,
ЭДТА, гепарин), в крови, взятой без
консерванта, в том числе взятой из пальца.
Гемолизированный образец должен быть
заменен новым образцом, хилезная кровь
также не используется.
Определение группы крови проводится в
помещении с хорошим освещением при
температуре 15-25° С.

28.

Инструкция по применению
Цоликлонов анти-А, анти-В и антиАВ
Приказ №2 МЗ РФ от 09.01.1998г.

29.

Назначение
Цоликлоны анти-А, анти-В и анти –АВ
предназначены для определения групп крови
человека системы АВО в прямых реакциях
гемагглютинации и применяются взамен или
параллельно поликлональным иммунным
сывороткам.

30.

31.

32.

Характеристика и основные свойства
цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ
Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются
двумя мышинными гибридомами и принадлежат к
иммуноглобулинам класса М.
Изготавливаются из асцитной жидкости мышейносителейанти-А и анти-В гибридом.Цоликлон анти-АВ
представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В
антител.
Технология изготовления реагента исключает возможность
контаминации патогенными для человека вирусами.

33.

Определение группы крови человека системы
АВО с помощью цоликлонов
Определение производится в нативной крови, взятой в
консервант, без консерванта, в том числе, взятой из
пальца.
Используется метод прямой гемагглютинации на
плоскости.
Определение группы крови производится в помещении с
хорошим освещением при температуре +250С

34.

Техника определения групп крови человека
системы АВО с помощью цоликлонов
1. Нанесите на планшет или пластину индивидуальными
пипетками Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по
одной большой капле ( 0.1 мл) под соответствующими
надписями.
2. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой
капле исследуемой крови(0,01-0,03 мл).
3. Смешайте кровь с реагентом.
4. Наблюдайте за ходом реакции с Цоликлонами визуально
при лёгком покачивании пластины в течение 3 минут.

35.

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
Положительный результат
При отрицательной реакции
Выражается в агглютинации
(склеивании) эритроцитов.
Капля остаётся
равномерно окрашенной в
красный цвет.
Агглютинаты видны
невооруженным глазом в виде Агглютинаты в ней не
мелких красных агрегатов,
быстро сливающиеся в крупные обнаруживаются.
хлопья.

36.

При взаимодействии АГ+АТ возможны
реакции:
▪ агглютинация
▪ преципитация
▪ гемолиз
Эта реакция (АГ+АТ) специфична и обратима, т.к. связи могут
разрываться (элюция)

37.

2 фаза
Вторым активным центром АТ фиксируется на
детерминантах других эритроцитов и образуется решётка.
Именно эта фаза определяется «глазом». Это и есть
агглютинация.

38.

НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ РЕАКЦИИ АГ+АТ УСЛОВИЯ
1. Идентичность АГ и АТ («ключ к замку»)
2. Количественное соотношение молекул АГ и АТ, особенно во 2ю фазу (поэтому при определении АГ АВО - соотношение
1:10). При нарушении соотношения — реакция не идёт.
Феномен «прозоны». Агглютинация слабая или
отсутствует.
3. АГ должен быть активным (достаточно экспрессивным)
4. Принадлежность АТ к определённому классу. JgМ в реакцию
вступают быстрее.
5. Необходимая температура. АТ бывают тепловые и холодовые.
(тепловые при t > 27 оС работают хуже. Тепловые АТ
взаимодействуют при t 37 оС.

39.

6. Необходимая рН среды. Анти-А и анти-В АТ менее
прихотливы: рН ≈ 7. Анти Rh — АТ: рН ≈ 7,6-8.
7. Необходимая концентрация электролитов. Ионы Na и Cl
нейтрализуют противоположные заряды ионов АТ.
8. Состояние среды. В норме эритроциты отталкиваются.
Коллоиды и протеолитические ферменты уменьшают это
отталкивание, что позволяет сближению и возможности
взаимодействия АТ с мембраной эритроцитов ( добавление
каллоидных растворов: полиглюкина, желатина и др.).
Сближению также способствует центрифугирование.
9. Время реакции (инкубация). При уменьшении времени —
не наступает 2 фаза. При увеличении времени АТ «уходят» от
АГ эритроцитов — агглютинация уменьшается.

40.

41.

42.

Метод агглютинации в геле для определения
антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных
антител
Гелевая технология в микропробирках была предложена Y.Lapierre в
1989г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле
«сефадекс», помещенном в микропробирки. Методика агглютинации в геле
была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и
получения достоверных результатов.
Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при
центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят
через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время
как агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности или в
толще геля (положительный результат).

43.

Оценка результатов реакции агглютинации в гелевом
тесте
отрицательный (-) – эритроциты формируют на дне микропробирки
компактный осадок.
очень слабоположительный (1+) – агглютинаты располагаются в нижней
трети геля;
слабоположительный (2+) – агглютинаты фиксированы в верхних двух третях
геля;
положительный (3+) – агглютинаты располагаются в верхней трети столбика
геля;
сильноположительный (4+) – образовавшиеся агглютинаты эритроцитов
задержались на поверхности геля.

44.

Причины ошибок при исследовании
групповой принадлежности крови
• технические погрешности
• недостаточно высокое качество реактивов
• индивидуальные особенности исследуемой
крови

45.

Технические ошибки при исследовании групповой
принадлежности
• Неправильная маркировка пробирок с кровью, взятой на
исследование (перепутывание пробирок от разных
индивидов);
• Ошибочный порядок нанесения агглютинирующих сывороток
или цоликлонов на планшет, неправильная регистрация
результатов исследования;
• Нарушение техники исследования:
- неправильное соотношение цоликлонов (сыворотки) и
исследуемых эритроцитов;
- использование реактивов с истекшим сроком годности;
- сокращение времени наблюдения за реакцией;
Проведение исследования при температуре окружающей
среды выше 25 °С, что может привести к
ложноотрицательной реакции.

46.

\
Характер затруднений при
определении группы крови
1. Полиагглютинабельность эритроцитов
2. Изменением свойств крови при
патологических состояниях (снижение активности АГ
и АТ)
3. Наличие в исследуемой крови слабых и
вариантных АГ эритроцитов систем АВО и Резус
4. Кровяные химеры

47.

Кровяные химеры — одновременное присутствие в крови
эритроцитов разных групп крови по системе АВО или
разных фенотипов по системе Резус
ИСТИННЫЕ
встречаются у
разнояйцевых
близнецов и при
пересадке
аллогенного
(донорского)
костного мозга
ТРАНСФУЗИОННЫЕ
появляются после
массивных гемотрансфузий
(2-3 л) или многочисленных
при переливании О(I) в
А(II), В(III), при
переливании неидентичной
по резус — фенотипу
крови. Нестойкие, исчезают
через 2-3 месяца. Хорошо
выявляются в гелевом
тесте; на плоскости —
мелкая агглютинация на
розовом фоне

48.

Частота аллоиммунизации в
некоторых популяциях
- В США -2,4%, наиболее часто выявляются антиК и
антиЕ- АТ
- В Индии – 3,5%, преимущественно анти-с
- В России - 3-4%, наиболее часто антиD, что связано с
отсутствием профилактики сенсибилизации Dотрицательных женщин при беременности Dположительным плодом.

49.

Показания для индивидуального подбора
Отягощенный трансфузионный или акушерский анамнез
(реакции и осложнения на прежние гемотрансфузии,
беременности, закончившиеся рождением новорожденных с
желтухой или другими признаками ГБН)
Больные, имеющие антиэритроцитарные аллоантитела в
сыворотке
Положительный или сомнительный результат индивидуальных
проб на совместимость
Больные, которым предполагается проведение многократных
трансфузий (например, онкогематологические)
Новорожденные с признаками гемолитической болезни

50.

Классификация посттрансфузионных осложнений
иммунологического типа
НЕМЕДЛЕННЫЕ
(возникают в момент трансфузий в
течение нескольких часов)
ГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ
ФЕБРИЛЬНЫЕ
НЕГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ
КРАПИВНИЦА
АНАФИЛАКТИЧЕСКИЕ
ОСТРАЯ ЛЁГОЧНАЯ
НЕДОСТАТОЧНОСТЬ
СВЯЗАННАЯ С
ТРАНСФУЗИЕЙ
ОТСРОЧЕННЫЕ
(возникают через несколько дней,
месяцев или лет после
трансфузии)
ГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ
АЛЛОИММУННЫЕ
ТРОМБОЦИТАРНОРЕФРАКТЕРНЫЕ
БОЛЕЗНЬ
«ТРАНСПЛАНТАНТ
ПРОТИВ ХОЗЯИНА»
ИММУНОМОДУЛЯТОРН
ЫЕ

51.

Интерпретация результатов лабораторного
расследования
Подтверждением иммунного характера возникшего
посттрансфузионного осложнения являются:
Положительный ПАГТ (прямой антиглобулиновый
тест – прямая проба Кумбса)
Положительный НАГТ (непрямой
антиглобулиновый тест – непрямая проба Кумбса)
Снижение титра АТ
Наличие кровяных химер

52.

Спасибо за внимание!