Диагностика групп крови системы АВ0

1. Диагностика групп крови системы АВ0

Королёва Е.А.
К.м.н. доцент кафедры
терапии и общей врачебной практики
с курсом ДПО ФГБОУ ВО «АГМУ»

2. Постановление Правительства 797 от 22 июня 2019

Правила заготовки, хранения, транспортировки и
клинического использования донорской крови и ее
компонентов
Врач, проводящий трансфузию (трансфузиолог или лечащий
врач или дежурный врач, прошедшие обучение по
вопросам трансфузиологии):
Первичное определение группы крови АВ0 и резусфактора (антигены А, В, D) при поступлении пациента,
нуждающегося в трансфузии
В КДЛ:
Подтверждающее исследование
1. антигены А, В, А1,
2. антитела анти-А и анти-В IgM (естественные агглютинины)
3. антиген D, антиген К
4. скрининг аллоиммунных антител (не менее 3 образцов эр)
5. антигены C, с, Е, e – девочки, женщины, реципиенты для
повторных трансфузий, с антителами или ПТО в анамнезе

3. Система АВ0 – основная серологическая система, определяющая совместимость или несовместимость переливаемой крови Антигены

системы АВ0 – в эритроцитах,
лейкоцитах, тромбоцитах и тканевых клетках
организма. Агглютиногены (антигены) – А и В.
Антиген 0 – не вызывает агглютинацию, не
имеет практического значения.
Антитела – в плазме или сыворотке
Агглютинины (естественные антитела):
Анти-А IgM
Анти-В IgM

4.

Группа
Русские
Мир
0
А
В
АВ
33,5
37,8
20,6
8,1
45
35
13
7

5.

6. Антиген А

Варианты: А1, А2, А3, А4 … и т.д.
А1 – быстрая крупнозернистая агглютинация
А2 (около 12%) – мелкая отсроченная
агглютинация
Цоликлон (Лектин) Анти-А1 – только для
выявления варианта А1.
Антиген А1 сильнее, чем А2. Введение
эритроцитов А1 пациенту с А2 может
вызвать иммунизацию.
Вторая группа: подгруппы А (это А1) и А2
Четвертая группа: АВ (это А1В) и А2В

7. А1 Асл А2

8. Антиген В

Варианты: В1, В2, В3, … и т.д.
В1 – быстрая крупнозернистая
агглютинация
В2 (встречается крайне редко) –
мелкая отсроченная
агглютинация
В2 не имеет практического
значения.

9. Антитела системы АВ0

Агглютинины анти-А IgM и анти-В IgM
естественные, полные, холодовые,
термолабильные иммуноглобулины
У новорожденных развиты слабо
Появляются на 1-2 месяце жизни, максимум
– к 10 годам,
после 50 лет титр может снижаться
Титр антител – это максимальное
разведение сыворотки, при котором
антитела в ней еще агглютинируют
эритроциты

10.

У лиц групп А2 и А2В встречаются
ЭКСТРААГГЛЮТИНИНЫ анти-А1
Экстраагглютинины полные, холодовые,
анти-А1 IgM, но могут быть и неполные
анти-А1 Ig G
Частота встречаемости экстраагглютининов
с подгруппах А2 и А2В – до 20%
Выявляются в определении группы АВ0
перекрестным методом (исследуемая
сыворотка + стандартные эритроциты А)
или в пробе на совместимость по АВ0

11.

Если в организм человека попадают чужеродные
антигены А или В, происходит иммунизация –
выработка иммунных антител полной IgM и
неполной IgG формы.
Иммунизация может быть при:
разногруппной беременности
несовместимой трансфузии
Иммунные антитела, в отличие от естественных
антител анти-А и анти-В, введенные
реципиенту, не связываются с плазменными
антигенами А и В, а разрушают его эритроциты.
Наиболее часто они вырабатываются у людей
группы крови 0.

12.

• Переливание более 500 мл донорской крови
группы 0, с иммунными антителами анти–А, анти–
В, реципиентам А, В, АВ группы может привести к
ПТО, у детей - к летальному исходу
• Донор группы крови 0 с иммунными антителами
анти – А или анти – В в его плазме - «опасный»
универсальный донор
• Такая цельная кровь может быть перелита
только реципиентам группы 0
• отмытые эритроциты 0 (без плазмы) являются
как бы универсальной трансфузионной средой и
могут быть перелиты реципиентам любой группы
по АВ0 при необходимости

13.

Методы
определения группы
крови системы АВ0

14.

Приказ №2 МЗ России от 09.01.1998 г. –
отменен с 2021 г.
Методические указания МУ ФМБА
России 11.61-2017
"Иммуногематологическое обследование
доноров крови и (или) ее компонентов и
реципиентов"
(утв. Федеральным медикобиологическим агентством 14 ноября
2017 г.)

15.

Приказ №2 МЗ России от 09.01.1998 г. –
отменен с 2021 г.
МУ ФМБА России 11.61-2017 При поступлении пациента
в организацию клинической трансфузиологии врач
клинического отделения проводит первичное
определение АВ0 с помощью моноклональных антител
анти-А, анти-В IgM или с применением стандартных
гемагглютинирующих сывороток анти-АВ, анти-В и антиА
Моноклональные антитела = Цоликлоны анти-А и анти-В

16.

В клинико-диагностической лаборатории
исследуется:
Группа крови АВ0 определяется перекрестным
способом с моноклональными антителами
анти-А, анти-В и стандартными эритроцитами
0, А, В
Любые расхождения должны быть выяснены и
разрешены до переливания. Заключение о
групповой принадлежности крови делается на
основании первичного и повторного
исследований

17.

Определение группы крови системы АВ0 с помощью
моноклональных антител на плоскости
Определение наличия или отсутствия антигенов А и В
на эритроцитах
Исследование выполняется на плоскости (пластине,
планшете) при комнатной температуре (18-25°С) в
помещении с хорошим освещением
Порядок проведения исследования
1. Промаркировать пластину: Ф.И.О., анти-А, анти-В
2. Нанести по одной капле 50 мкл анти-А и анти-В
3. Рядом нанести по маленькой капле 10 мкл
эритроцитов из пробирки с исследуемой кровью
4. Капли перемешать, покачать пластину
5. Результат оценить через 5 мин

18.

Положительный результат - агглютинация эритроцитов
При отрицательной реакции капля остается окрашенной
равномерно в красный цвет - 5 мин
Интерпретация результатов
Положительная реакция свидетельствует о наличии в
исследуемых эритроцитах антигена, к которому
направлены моноклональные антитела
- При отрицательной реакции с анти-А и анти-В
исследуемая кровь принадлежит к группе 0
- При положительной реакции только с анти-А - к группе А
- При положительной реакции только с анти-В - к группе В
- При положительной реакции с реактивами анти-А и
анти-В - к группе АВ

19.

Контроль специфичности
При положительном результате реакции с обоими
реагентами (анти-А, анти-В) необходимо исключить
неспецифическую агглютинацию
Для этого на плоскость наносят одну каплю
изотонического 0,9% раствора хлорида натрия и
маленькую каплю исследуемых эритроцитов - объемное
соотношение 5:1 , перемешивают и покачивают
При отсутствии в капле смеси агглютинации 5 мин
делают заключение о принадлежности исследуемого
образца к группе АВ

20.

Определение группы крови системы АВ0
перекрестным методом на плоскости
Определение группы крови перекрестным способом это определение антигенов А и В в эритроцитах при
помощи Цоликлонов анти-А, анти-В, а также выявление
в исследуемой сыворотке анти-А, анти-В антител при
помощи стандартных эритроцитов 0, А и В.
Для исследования используют кровь, заготовленную с
консервантом или без консерванта. Определение
проводится в помещении с хорошим освещением на
пластине или специальном планшете при температуре
18-25°С.

21.

Порядок проведения исследования
1. Промаркировать пластину:
- Ф.И.О.
- цоликлоны анти-А, анти-В
- стандартные эритроциты 0 А В
2. Нанести по одной капле 50 мкл анти-А и анти-В
3. Нанести по одной маленькой капле (10 мкл)
стандартных эритроцитов 0, А, В.
4. К эритроцитам добавить по 2 капли исследуемой
сыворотки (100 мкл).
5. Нанести по одной капле (10 мкл) исследуемых
эритроцитов рядом с каплями анти-А и анти-В
6. Капли перемешать, покачать пластину
7. Оценить результат через 5 мин

22.

Интерпретация результатов
Положительный результат - агглютинация эритроцитов
При отрицательной реакции капля остается
окрашенной равномерно в красный цвет - 5 мин
Положительная реакция свидетельствует о реакции
антиген + одноименное антитело
- При отрицательной реакции с анти-А и анти-В кровь
принадлежит к группе 0, при этом определяется
агглютинация с эритроцитами А и В
- При положительной реакции только с анти-А - к
группе А, агглютинация также с эритроцитами В
- При положительной реакции только с анти-В - к
группе В, агглютинация также с эритроцитами А
- При положительной реакции с реактивами анти-А и
анти-В - к группе АВ, агглютинации с эритроцитами нет

23.

Контроль специфичности
При положительном результате реакции с обоими
реагентами (анти-А, анти-В) необходимо исключить
неспецифическую агглютинацию
Для этого на плоскость наносят одну каплю
изотонического 0,9% раствора хлорида натрия и
маленькую каплю исследуемых эритроцитов объемное соотношение 5:1 , перемешивают и
покачивают
При отсутствии в капле смеси агглютинации 5 мин
делают заключение о принадлежности исследуемого
образца к группе АВ

24.

В капле со стандартными эритроцитами 0 не должно
наблюдаться агглютинации, независимо от АВ0
принадлежности исследуемой крови.
Для определения антигена А1 на плоскость наносят
одну каплю (50 мкл) реактива анти-А1 и маленькую
каплю (10 мкл) исследуемых эритроцитов
Перемешивают и наблюдают в течение 5 мин
При выявлении агглютинации делают заключение о
наличии сильного антигена A1, при отсутствии
агглютинации - о наличии подгруппы антигена А2
Если при исследовании сыворотки крови человека с
подгруппой А2 или А2В наблюдается агглютинация со
стандартными эритроцитами А - делают заключение о
присутствии в исследуемой крови экстраагглютининов
анти-А1

25.

Общие принципы определения группы крови
Эритроциты Аg A + сыворотка анти-А = агглютинация
Эритроциты А + сыворотка анти-В = нет агглютинации
Антиген+ одноименное антитело = агглютинация!!
Задача:
Эритроциты пациента + цоликлон анти-А = агглютинация
Какой антиген в эритроцитах?
Ответ: агглютинация произошла с антителами анти-А,
значит выявлен одноименный антиген А в эритроцитах.
Стандартные эритроциты В + сыворотка пациента =
агглютинация. Какие антитела в сыворотке?
Ответ: агглютинация произошла, значит антитела в
сыворотке пациента выявлены - одноименные, анти-В

26.

Гелевая технология для определения
группы крови системы АВ0
Lapierre (Швейцария), 1990 г.
Метод основан на агглютинации
эритроцитов в геле, помещенном в
микропробирки
Пластиковые карты, содержащие 6 или 8
микропробирок, заполненных гелем
Для определения группы крови АВ0
используют карту, в микропробирки с
гелем которой добавлены цоликлоны

27. Определение титра агглютининов

Для определения титра агглютининов в
исследуемой сыворотке приготавливают ее
последовательные разведения в физрастворе. Для
этого подписывают 10 точек пластинки – 1:2, 1:4,
1:8, …1:1024. В каждую точку добавляют по 1
большой капле (0,1 мл) физраствора. Затем в 1ю
точку добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки,
перемешивают капли, а затем той же пипеткой
переносят большую каплю во вторую точку,
перемешивают, затем в третью, и т.д. до десятой,
получая таким образом последовательные
разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
На пластинку рядом с каждой каплей разведенной
сыворотки наносят каплю стандартных
эритроцитов (0,01 мл) - А1, если титруют
агглютинины альфа, или В, если титруют бета.

28.

Гелевая технология для определения
группы крови по системе АВ0
Оборудование: центрифуга, дозатор на
10-50 мкл с переменным объемом,
наконечники
Реагенты:
Диагностическая гелевая карта
Раствор для разведения эритроцитов
Эритроциты исследуемого лица

29.

Внести в обычную пробирку 1 мл
раствора для разведения эритроцитов
Добавить 10 мкл эритроцитов,
перемешать
Снять фольгу с гелевой карты, открыв
микропробирки
Перенести 50 мкл разведенных
эритроцитов в каждую микропробирку с
гелем
Центрифугировать 10 минут в
специальной центрифуге

30.

При центрифугировании происходит
разделение агглютинированных и
неагглютинированных эритроцитов
Неагглютинированные свободно проходят
сквозь частицы геля, формируя на дне
микропробирки компактный красный осадок
– антиген системы АВ0 – не выявлен.
Агглютинированные эритроциты ввиду
больших размеров задерживаются на
поверхности или в толще геля –
соответствующий антиген А или В – выявлен

31. Определение титра агглютининов

Гелевая технология для пробы на совместимость по системе
Резус , Келл и др.
При центрифугировании происходит разделение агглютинированных и
неагглютинированных эритроцитов
Неагглютинированные имеют размер сравнимый с частицами геля,
свободно проходят сквозь них, формируя на дне микропробирки
компактный красный осадок – кровь донора и реципиента
совместима по системе Резус и др.
Агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров
задерживаются на поверхности или в толще геля – кровь
несовместима

32.

РЕЗУЛЬТАТЫ
Сильноположительный 4+ (агглютинаты
только на поверхности геля)
Положительный 3+ (агглютинаты в верхней
трети столбика геля)
Слабоположительный 2+ (агглютинаты
фиксированы в верхних 2/3 геля)
Очень слабо положительный 1+
(агглютинаты в нижней трети геля)
Отрицательный – компактный осадок на дне

33. Определение титра агглютининов

Гелевая технология для пробы на совместимость по системе
Резус , Келл и др.
При центрифугировании происходит разделение агглютинированных и
неагглютинированных эритроцитов
Неагглютинированные имеют размер сравнимый с частицами геля,
свободно проходят сквозь них, формируя на дне микропробирки
компактный красный осадок – кровь донора и реципиента
совместима по системе Резус и др.
Агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров
задерживаются на поверхности или в толще геля – кровь
несовместима

34.

Гелевые карты хранятся при комнатной
температуре +18-25 ºС в вертикальном
положении
Над гелем в микропробирке должен быть
виден слой жидкости, без него гель
подсыхает
Если слой жидкости почти не виден, нужно
центрифугировать закрытые микропробирки
до проведения исследований, он появится
Раствор для разведения эритроцитов
хранится в холодильнике +2-8 ºС

35. Колоночная агглютинация с использованием микросфер BioVue

Центрифугирование: центробежная сила
Основание колонки
заполнено стеклянными
шариками
Шарики –
препятствие
для
агглютинированных
эритроцитов
положительная
Отдельные
эритроциты
без труда
проходят
между
шариками
отрицательная

36. Метод колоночной агглютинации со стеклянными микросферами

Оборудование: центрифуга, дозатор на 1050 мкл с переменным объемом,
наконечники
Реагенты:
Диагностическая кассеты
Физраствор для разведения эритроцитов
Эритроциты исследуемого лица

37. Метод колоночной агглютинации со стеклянными микросферами

Внести в обычную пробирку 1 мл
физраствора
Добавить 10 мкл эритроцитов,
перемешать
Снять фольгу с кассеты
Перенести 50 мкл разведенных
эритроцитов в каждую микропробирку
Центрифугировать в специальной
центрифуге 5 минут

38. Колоночная агглютинация с использованием микросфер BioVue

39. Группа 0 Резус +

40. Группа А2 с экстраагглютининами анти-А1

41. Группа В Резус +

42. Группа АВ Резус -

43. Причины ошибок и их предупреждение

Определяющий группу крови считает, что
агглютинации нет, а она фактически есть или
должна появиться:
дальнозоркость - очки!
цоликлоны слабоактивны - срок годности!
исследуемые эритроциты обладают слабой
агглютинабельностью - экспозиция 3 мин!
оч. большая капля крови - соотношение 1:10!
температура выше 25 °С – охладить!

44.

Определяющий группу крови предполагает, что
произошла агглютинация, а она фактически
отсутствует
дальнозоркость - очки!
фантазия - замена исследователя!
«монетные столбики» или скопления осевших
эритроцитов при позднем просмотре
результата - физраствор и покачать пластинку!
ауто- или панагглютинация – контроль с
физраствором и контроль температуры не ниже 15°С !

45. Трудности при определении

Вызваны изменением свойств крови при
различных патологических состояниях
1. Специфическая и неспецифическая холодовая
агглютинация станд. эритроцитов сывороткой
больного ( и в пробе на совместимость по АВ0 )
(Цирроз печени, ожоги, гнойно-септические
состояния, онкологические и гематологические
заболевания, АИГА, ГБН)
Показатель: агглютинация исследуемой
сыворотки станд. эритроцитами 0
Специфические – антитела к антигенам M, N, S,
s, I, i, H, P, агглютинируют станд.эр.избирательно
Неспецифические – не опасны, но затрудняют
определение группы крови

46. Трудности при определении

2. Холодовая агглютинация исследуемых
эритроцитов со всеми цоликлонами
(полиагглютинабельность)
проба с физраствором – положительная!!!
отмыть трижды теплым 37ºС физраствором
3. Аутоагглютинация эритроцитов больного (в
том числе с собственной сывороткой)
Аутоконтроль положительный!
кровь - в теплом виде доставить в
лабораторию

47.

4. Приобретенный антиген В у больных с
группой крови А
при заболеваниях кишечника и инфекционных
заболеваниях, вызванных Грам(-) бактериями
Под действием микробных ферментов
расщепляется N-ацетилгалактозамин в
эритроцитах А
Приобретенный антиген В реагирует со
стандартной сывороткой II группы (слабая поздняя
агглютинация, как В2), но не реагирует с
цоликлоном анти-В
Таким больным нельзя переливать плазму II
группы , можно только IV - без антител

48.

5. Низкая активность агглютининов
исследуемой крови (сыворотки)
у новорожденных
у пожилых
при онкологических и гематологических
заболеваниях, ожогах и др.
перекрестный метод затруднен
определяют при охлаждении планшета
для усиления агглютинации со
стандартными эритроцитами или только
цоликлонами

49.

6. Низкая активность антигенов
исследуемой крови (эритроцитов)
у беременных
у пожилых
при онкологических и
гематологических заболеваниях
желательно определять не
цоликлонами, а в гелевых
диагностических картах или методом
колоночной агглютинации

50.

7. Присутствие антигена А2
реагирует с цоликлоном Анти-А
не реагирует с лектином Анти-А1
со стандартными сыворотками I и III
групп давал слабую отсроченную
агглютинацию

51.

8. КРОВЯНЫЕ ХИМЕРЫ
Это одновременное наличие разногруппных
эритроцитов в крови реципиента
Бывают истинные и трансфузионные
Истинные – у гетерозиготных близнецов или
после пересадки аллогенного костного мозга
Трансфузионные – после массивных (2-3 л)
трансфузий или многократных в короткие
промежутки времени – обычно эритроцитов 0
реципиентам А или В. Не стойкие – 2-3 месяца
Хорошо выявляются в диагностических картах
– 2 популяции эритроцитов

52. Химера у реципиента группы А, которому перелили эритроциты донора 0

53.

Наследование групп крови системы АВ0
Антигены А и В наследуются по отношению друг к
другу кодоминантно, а по отношению к антигену 0
– доминантно.
Антиген 0 наследуется по отношению к А и В –
рецессивно.
Группа 0 – всегда гомозиготна 00
Группа АВ – всегда гетерозиготна
Группы А и В могут быть гомо- и гетерозиготны
Например, эритроциты II группы крови содержат
АА или А0, III группы – ВВ или В0

54.

В наследовании групп крови есть несколько
очевидных закономерностей:
Если хоть у одного родителя группа крови 0,
в таком браке не может родиться ребёнок с
AB, вне зависимости от группы второго
родителя
Если у обоих родителей группа 0, то у их
детей может быть только группа 0.
Если у обоих родителей группа крови А, то у
их детей может быть только группа А или 0.

55.

Если у обоих родителей группа В, то у их
детей может быть только В или 0
Если хоть у одного родителя группа AB, в
таком браке не может родиться ребёнок с 0
группой, вне зависимости от группы второго
родителя.
Наиболее непредсказуемо наследование
ребенком группы крови у родителей с
группами А и В
Например, у гетерозигот А0 и В0 дети могут
быть любой группы: 00, А0, В0 и АВ

56.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!