Молекулярные аспекты нейропротекции

1.

Запорожский государственный медицинский
университет
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ
НЕЙРОПРОТЕКЦИИ
профессор И.Ф. Беленичев

2.

НЕЙРОИНФЕКЦИЯ
ЧМТ
МОЗГОВЫЕ
ИНСУЛЬТЫ
НЕЙРОДЕГЕНАРИТИВНЫЕ
ПАТОЛОГИИ
ПОСТГИПОКСИЧЕСКАЯ
ЭНЦЕФАЛОПАТИЯ
ХРОНИЧЕСКИЙ
АЛКОГОЛИЗМ
КОГНИТИВНЫЙ ДЕФИЦИТ

3. Стадии апоптоза

1. Инициации (индукции)
2. Эффекторная
3. Деградации
Факторы инициирующие нейроапоптоз цитокины, гормоны, АФК, дериваты NO,
окисленные тиолы, продукты окислительной
модификации белков и нуклеиновых кислот .
Первичная реакция стадинга нейроапоптоза
реализуется генами раннего реагирования
– c-fos

4. Стадии нейроапоптоза

5.

nNOS
(нейрональная
NOS)
iNOS
(индуцибельная
NOS)
NO синтезируется из
L-аргинина при участии
кислорода, НАДФ,
ионов Са2+ под действием
eNOS
(эндотелиальная
NOS)
нитрооксидсинтаз (NOS)
NOS
mNOS
(митохондриальная
NOS)

6. Проапоптические дериваты NO

NO в клетках мишенях образует активные дериваты,
такие как нитрозоний (NO+), нитроксил (NO–) и
пероксинитрит (ONOO). Исследованиями последних
лет установлено, что NO, и особенно продукты его
превращения, такие как пероксинитрит (ОNOO–), ион
нитрозония (NO+), нитроксил (NO–) и диазоттриоксид
(N2O3), являются основними факторами реализации
нитрозирующего стресса –реакции взаимодействия
NO+ (S, N, Oнитрозирование) с тиольными,
фенольными, гидроксильными и аминогруппами
белков и ДНК и инициации нейроапптоза

7.

Продукция О2
Наличие
Биологические
повреждения
L-Arg

8. А П О П Т О З

АПОПТОЗ
повышение концентрации
Са²+ в матриксе
выход цитохрома С
из митохондрий
усиление перекисного
окисления липидов
Ингибирование NOS
(L-NMMA),
поглотителем пероксинитрита
и экспрессией Bcl-2

9.

Нейродегенеративные
расстройства
Локальное
термическое
повреждение
мозга
Митохондриальная
дисфункция
Эпилептогенные
судороги
Транзиторная
церебральная
ишемия
Интрацеребральная
геморрагия

10.

Митохондриальная дисфункция - типовой
патологический процесс не имеющий
этиологической специфичности ,
характеризующийся нарушением продукции
и транспорта энергии , образованием АФК в
«паразитарных» энергетических реакциях,
повреждением мембран митохондрий и
ДНК , открытием митохондриальных пор,
экспрессисией проапоптических белков .

11. Продукция АФК при митохондриальной дисфункции

12.

Митохондриальная дисфункция - новый
патобиохимический механизм церебральной
патологии широкого спектра. Выделяют два
вида митоходриальной дисфункции –
первичную, как следствие врожденного
генетического дефекта и
вторичную, возникающую под действием
различных фактров: гипоксия, ишемия,
оксидативный и нитрозирующий стресс,
экспрессия провоспалительных цитокинов

13. Проявления первичной МД

MELAS – митохондриальная миопатия, энцефалопатия,
лактатный ацидоз, инсультоподобные эпизоды.
CPEO/PEO – офтальмоплегия, связанная с
поражением глазодвигательных мышц, офтальмоплегия
плюс синдром.
KSS – ретинопатия, слабость проксимальных
мышц, аритмия, атаксия.
MERRF – миоклоническая эпилепсия с
обнаружением RRF.
LHON – врожденная нейропатия глазного нерва.
Leig syndrome – инфинтильная подострая
некротизирующая энцефалопатия.
NAPR – нейропатия, атаксия и пигментная
ретинопатия.

14. Вторичные МД в качестве звеньев патогенеза

интрацеребральная геморрaгия, хроническое
нарушение мозгового кровообращения
эпилептогенные судороги, локальное
термическое повреждение мозга,
нейродегенеративные расстройства,
транзиторная церебральная ишемия, синдром
хронического утомления, мигрени,
кардиомиопатии, алкогольные энцефалопатии,
сенильная деменция, нейроинфекции,
кардиомиопатии, гликогенозы, болезни
соединительной ткани, диабет, рахит,
тубулопатии, панцитопения, гипопаратиреоз,
печеночная недостаточность и др.

15.

Открытие пор происходит за счет окисления
тиольных групп цистеин -зависимого участка
белка внутренней мембраны митохондрий
(АТФ/АДФ - антипортер), что превращает
его в проницаемый неспецифический каналпору. Открытие пор превращает
митохондрии из «электростанций» в «топку»
субстратов окисления без образования АТФ,
сопровождается снижением мембранного
потенциала, высокоамплитудным набуханием
митохондрий, разрывом внешней мембраны
и выходом проапоптотических факторов.

16.

Нарушение
обратного
захвата
медиаторов
( КХА, Ср, ДА, ГЛ )
«Паразитарные»
энергетические
реакции
Нарушение
ионного
транспорта,
генерации и
проведения
импульса
Нарушение
процессов
трансляции и
транскрипции
АТФ
Нарушение
синтеза
белка
de novo
Апоптоз
( некроз )
АТФ

17.

Глутаматная
эксайтотоксичность
Окислительная
модификация
м-ДНК
Избыток Ca++
Оксидативный
стресс
Дефицит О2
Гиперпродукция
NO и
нитрозирующий
стресс

18. «ГИПЕРЭКСПРЕССИЯ»

Кафедра фармакологии ЗГМУ
C-FOS
«НОРМОЭКСПРЕССИЯ»
АКТИВАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ,
ТРАНСКРИПЦИИ
СИНТЕЗ ПЛАСТИЧЕСКИХ
КОМПОНЕНТОВ КЛЕТКИ
«ГИПЕРЭКСПРЕССИЯ»
ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК,
АКТИВАЦИЯ NO-СИНТАЗЫ,
НАКОПЛЕНИЕ
ПЕРОКСИНИТРИТА

19. Схема работы HSP 70 в митохондриях

20. Шаперонная функция HSP70

21. Известные антиапоптические механизмы Hsp70

Hsp70 блокирует пусковой рецептор
апоптоза Fas/Apo-1
Hsp70 ингибирует апоптоз в митохондрии на
этапе между высвобождением цитохрома с и
расщеплением прокаспазы-9
Hsp70 препятствует связи цитохрома С с
проапоптическим белком Apaf-1 в
митохондрии

22.

Неврологический дефицит
средней степени тяжести
(животные с ОНМК
получавшие
нейропротективную
терапию)
Тяжелый
неврологический
дефицит (4 сутки
моделирования
ОНМК)

23. Метод гистоиммунохимии

24. Результаты гистоиммунохимического анализа

Локализация NOS в митохондриях нейронов сенсомоторной зоны мозга крыс
на 4-е сутки ОНМК , (Texas Red channel, orig. ×200)(а) ; локализация
нитротирозина в митохондриях нейронов сенсомоторной зоны мозга крыс на
4-е сутки ОНМК , (FITC, orig. ×200)( (b) ; комбинированное определение NOS
и нитротирозина (с)

25. Метод иммуноблотинга

26. Результаты иммунодетекции HIF 1а

27. Результаты иммунодетекции HSP 70

28. Антиапоптическое действие HSP 70 (80 мкг/мл)

Hsp70 тормозит домитохондриальный и
митохондриальный части сигналинга апоптоза

29. Уровень активности сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы в цитозольной (А) и митохондриальной (Б) фракциях нейронов, с моделированием

МФП-индуцированной гипоксией in
vitro, на фоне преинкубации с HSP70 (80 мкг/мл)
45
50
40
45
30
25
СДГ
20
МДГ
15
10
5
у.е./гр/белка/мин
у.е./гр/белка/мин.
35
40
35
30
СДГ
25
МДГ
20
15
10
5
0
фон. знач.
15 мин.
30 мин.
60 мин.
0
фон. знач
15 мин.
30 мин.
60 мин.

30. Hsh70 стабилизирует HIF-1a в митохондриях в условиях церебральной ишемии

70
кол-во белка, усл.ед.
60
50
40
HSP 70
Hif1б
30
20
10
0
0
15 мин.
30 мин.
60 мин.

31. Результаты регрессионного анализа взаимосвязи HSP и МДГ.

МДГ = -13,339+9,9521*log10(x)
3,2
3,0
МДГмитох., нмоль/г белка/мин.
2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
28
30
32
34
36
38
HSP, усл. ед.
40
42
44
46

32. Молекулярно-биохимические механизмы фрмирования МД

Мы предполагаем , что в ответ на формирование
ишемии головного мозга посредством
активации гена раннего реагирования c-fos
экспрессируется HIF-1a, который инициирует
запуск компенсаторных механизмов выработки
энергии. В дальнейшем регуляция этих
процессов переключается на HSP70 , который
«пролонгирует» действие HIF-1a, а также
самостоятельно поддерживает экспрессию
активности НАД-МДГ-мх, тем самым
длительно поддерживая активность малатаспартатного челночного механизма

33. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ НЕЙРОПРОТЕКЦИИ

1.
2.
3.
4.
Первичная нейропротекция
Антагонисты глутаматных рецепторов (NMDA, AMPA).
Агонисты ГАМК.
Агонисты глициновых рецепторов.
Антагонисты потенциалзависимых Са2+-каналов.
Вторичная нейропротекция (нейрометаболические церебропротекторы)
8.
Модуляторы энергетического метаболизма.
Митопротектры
Антиоксиданты
NO-модуцляторы
Ноотропы
Нейропептиды
Вазоактивные препараты
Эндотелиопротекторы
.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

34. Концепция нейропротекции

Концепция нейропротекции позволяет
выделить два основных направления терапии
мозгового инсульта. Первичная
нейропротекция направлена на прерывание
быстрых механизмов некротической смерти
клеток – реакций глутамат-кальциевого
каскада (антагонисты NMDA и AMPA
рецепторов и блокаторы кальциевых каналов

35. Вторичные нейропротекторы или нейрометаболические церебропоротекторы

Вторичная нейропротекция направлена на
уменьшение выраженности отдаленных
последствий ишемии – на блокаду
провоспалительных цитокинов, молекул
клеточной адгезии, торможение оксидативного
стресса, нормализацию нейрометаболических
процессов, ингибирование апоптоза
(антиоксиданты, ноотропы, нейропептиды –
цераксон, эмоксипин, тиотриазолин, глицин,
пирацетам, тиоцетам, церебролизин, кортексин,
цереброкурин и т.д.)

36.

Нейрометаболические
церебропротекторы –
лекарственные средства восстанавливающие
когнитивно-мнестические функции и
снижающие неврологические дефициты, за
счет нормализации продуктивной работы
митохондрий, уменьшения продукции АФК
биоэнергетическими и нейрохимическими
системами нейрона и снижение
нейроапоптоза.
( Ю.Б. Белоусов, 2003;
В.И. Мамчур, 2006 )

37. Влияние Цераксона (250 мг/кг) на развитие неврологического дефицита (средний бал по шкале C.P. Mc Grow) в различные сроки ОНМК

25
Баллы
20
*
15
*
10
5
0
4 сутки
- Контроль (ишемия)
*
- Цераксон (250 мг/кг)
* - p< 0,05 по отношению к контролю
21 сутки

38. Влияние Цераксона(250 мг/кг) на продукцию энергии в тканях головного мозга крыс с моделированием ОНМК

3,5
Ммоль/г/ткани
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
АТФ
АДФ
АМФ
Малат
Пируват
- Контроль (ишемия)
- Интакт
- Цераксон (250 мг/кг)

39. Влияние Цераксона (250 мг/кг) на транспорт и расход энергии животных с моделированием ОНМК

ммоль/гр/ткани
Влияние Цераксона (250 мг/кг) на транспорт и
расход энергии животных с моделированием
ОНМК
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
*
мКФК
- Интакт
*
цКФК
АТФ-аная
активность
- Цераксон (250 мг/кг)
- Контроль (ишемия)
* - p< 0,05 по отношению к контролю

40. Влияние Цераксона на характеристику нейронов IV-V слоев коры головного мозга крыс с экспериментальной ишемией

80
% от контроля
60
40
20
0
-20
-40
Площадь
нейронов
Пл-ть
нейронов
РНК
Кол-во
деструкт.
Нейронов
Нейроны IV-V слоев коры головного
мозга контрольной группы животных
(4-е сутки экспериментальной ишемит)
-60
-80
Нейроны IV-V слоев коры головного
мозга животных с курсовым назначением
(4 суток) ЦЕРАКСОН

41. Влияние Цераксона (250 мг/кг) на открытие митохондриальной поры нейроцитов крыс с ОНМК (4 сутки)

120
*
100
80
60
40
20
0
Интакт
ОНМК
ЦРК
Циклоспорин А чувствит. поглощ.
света (540 нм)
Циклоспорин А-чувствит. поглощ.
(540 нм)
Влияние Цераксона
(250 мг/кг) на открытие
митохондриальной поры нейроцитов
крыс с ОНМК (4 сутки)
Влияние Цераксона (1 мкг) на
индуцированное Ca2+ (0,6мМ) и
глутаматом (100мкМ) открытие
митохондриальной поры
нейроцитов in vitro
80
*
70
60
50
40
30
20
10
0
Интакт
Инд. in vitro
Инд. + ЦРК
Примечания:
ЦРК – ЦЕРАКСОН
* - p< 0,05 по отношению к контролю (ОНМК; Индукция in vitro)

42. Окислительная модификация белков в суспензии митохондрий животных, с моделированием ОНМК

3,5
АФГ
КФГ
3
*
1,5
*
1
ОНМК
ОНМК+ЦРЛ
6
2,5
2
Интакт
7
мкмоль/гр/белка
у.е/гр/белка
Окислительная модификация
Влияние цераксона(250мг/кг) на
белков в суспензии
показатели окислительного
митохондрий животных,
метаболизма гололвного мозга у
с моделированием ОНМК
крыс, с моделированием ОНМК
5
4
*
*
*
3
2
1
0,5
0
0
Интакт
ОНМК (Контр.)
ОНМК+ЦРЛ
АТФ
Примечание:
ОНМК- острое нарушение мозгового кровообращения
ЦР - ЦЕРАКСОН
* - p< 0,05 по отношению к контролю
Малат
Лактат

43. Индекс выживших/погибших нейронов на мм2 в IV-V слое коры головного мозга у крыс с моделированием ОНМК

Влияние цераксона(250 мг/кг) на
Индекс выживших/погибших нейронов на
мм2 в IV-V слое коры головного мозга у крыс содержание bcl-2 белка в нейронах IVс моделированием ОНМК
V слое коры головного мозга крыс с
70
60
*
50
40
30
20
10
0
Интакт
ОНМК
ЦРК
число клеток, мм2
выжившие/погибшие
80
ОНМК
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*
Интакт
А
Б
ОНМК
ЦРК
В
Нейроны сенсомоторной зоны фронтальной коры животных интактной
группы (А), и у крыс с ишемией (Б) и введением цераксона (В) на 21-е сутки
эксперимента (Окраска галлоцианин-хромовыми квасцами, увеличение х
100 ).

44. Влияние Цераксона(250мг/кг)на экспрессию гена c-fos в IV-V слое коры головного мозга крыс с ОНМК

250
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Латентное время захода
животных с моделированием
ОНМК в темный отсек в тесте
УРПИ
200
Сек.
число клеток, мм2
Влияние
Цераксона(250мг/кг)на
экспрессию гена c-fos в IV-V
слое коры головного мозга
100
90 крыс с ОНМК
150
100
50
0
Интакт
ОНМК
Интакт
ЦРК
А
ОНМК
ЦРК
Б
Экспрессия гена c-fos в IV-V слое коры головного мозга крыс с
ОНМК (А) и у животных с введением Цераксона (Б)

45. ОБУЧЕНИЕ

Кафедра фармакологии ЗГМУ
ОБУЧЕНИЕ
C - FOS
СИНТЕЗ
РЕГУЛЯТОРНЫХ
БЕЛКОВ
КОНСОЛИДАЦИЯ
ПАМЯТИ

46. Влияние Цераксона на эксперессию HSP70 в нейронах коры на 4-е сутки ОНМК

Экспрессия белка HSP70 в нейронах сенсомоторной зоны коры крыс
(электрофореграмма).
1- контроль; 2-интакт; 3-Цераксон